骨髓基质细胞移植对大鼠脊髓损伤后神经细胞凋亡的影响

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作者：于德水，吕刚，梅晰凡，张勇，曹阳，智晓东，范中凯 【摘要】

目的 研究骨髓基质细胞（bmscs）移植对大鼠脊髓损伤（sci）后神经细胞凋亡的影响，探讨骨髓基质细胞移植治疗脊髓损伤的机制。方法 取大鼠股骨和胫骨骨髓培养bmscs并传代。参照taoka?s方法制作大鼠脊髓压迫损伤模型。脊髓损伤后30 min，进行bmscs或dmem培养液损伤周围局部四点注射。在术后3、7和14 d，应用tunel方法检测脊髓损伤周围神经细胞凋亡情况。结果 脊髓损伤后，损伤区周围组织内tunel阳性细胞数量明显增加，阳性细胞分布于脊髓灰质和白质内，但以白质内神经细胞为主。与dmem组大鼠相比，移植术后3、7和14 d，bmscs移植显著减少脊髓损伤周围区凋亡的神经细胞数目（p<0.05）。结论 脊髓损伤后，bmscs移植能够抑制神经细胞凋亡。

【关键词】 脊髓损伤 骨髓基质细胞 细胞移植 凋亡

abstract:objective to study the effects of bone marrow stroma cells(bmscs) transplantation on apoptosis of neural cells after spinal cord injury(sci),and to approach on the mechanism of repairing the sci by bmscs transplantation.methods obtained from rat femurs and tibias, bmscs are cultivated and generated. the sci model was made by consulting the taoka ?s method. rats were received four injections at peri-lesion area of bmscs or dmem culture fluid at 30 minutes after sci. the change of apotosis was observed with tunel method in spinal cord at 3, 7 and 14 days after the transplantation. results the numbers of tunel-positive cells increased approximately 1 to 2 mm from the injury epicene after sci. the tunel-positive cells were present in both gray and white matter of the spinal cord, but mainly in white matter. with bmscs transplantation, the number of tunel-positive cells around the lesion epicenter were significantly reduced compared with that of dmem treatment at 3, 7 and 14 day after transplantation (p<0.05). conclusions bmscs transplantation may inhibit apoptosis of neural cells in spinal cord tissue after spinal cord injury (sci).

key words：spinal cord injury; bone marrow stromal cells; cells transplantation; apotosis

骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells，bmscs)在修复神经退变性疾病和创伤性损伤方面的潜力已成为研究的热点。近年来，国内外大量文献报道，bmscs移植可明显改善脊髓损伤（spinal cord injury，sci）后的神经功能，但bmscs治疗脊髓损伤的作用机制仍然不清。我们的前期实验发现bmscs移植能够上调损伤脊髓组织内血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，vegf）及其受体胎肝激酶-1（ fetal liver kinase-1，flk-1）的表达［1,2］，而vegf与flk-1结合所介导vegf的一个重要生物学作用是促进神经保护。故本研究拟利用tunel方法，验证bmscs是否能够下调损伤脊髓组织内的神经细胞凋亡，探讨bmscs移植治疗脊髓损伤的可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

wistar雌性大鼠（辽宁医学院实验动物中心提供）。低糖dmem培养基、胰蛋白酶、胎牛血清（gibco公司，美国）。细胞凋亡检测试剂盒（北京中山生物技术有限公司）。

1.2 骨髓基质细胞培养

取4 周大小wistar大鼠（体重120 g左右），断头处死后立即无菌条件下取双侧股骨和胫骨，用pbs（phosphate-buffer saline solution；0.1 m；ph 7.4）清洗干净。用剪刀除去股骨和胫骨两端，暴露骨髓腔。用无菌5 ml注射器从骨的一端反复注入dmem培养液冲洗骨髓腔，在另一端收集。将收集的骨髓反复抽吸吹打，制成单细胞悬液。收集细胞悬液，800×g离心5 min去除碎片，然后用含10%胎牛血清的dmem培养液重新悬浮沉淀的细胞。吹散后调整骨髓细胞密度，将细胞稀释后按2.5×105个/cm3密度接种塑料培养瓶，置37 ℃，湿度95%和5%co2培养箱中培养。24 h后通过首次全量换液去除未贴壁的细胞，以后每隔2～3天换液1 次，倒置相差显微镜下观察细胞生长状况。当细胞达到80%～90%融合时，用0.25%胰蛋白酶消化后轻柔吹打使之成为单细胞悬液，然后按1∶3传代扩增。细胞传3～4代，移植前用无血清dmem洗涤细胞3 次，500×g离心后重悬于无血清dmem中，0.3%胎盘蓝检测细胞活力，调整细胞终密度2.5×104个/μl存于冰上备用。

1.3 脊髓损伤模型制作和实验动物分组

wistar大鼠，10%水合氯醛（3 ml/kg）腹腔注射麻醉，参照taoka′s脊髓压迫损伤模型制作方法，略加改动。动物俯卧固定,背部剪毛后，常规消毒后铺无菌孔巾，以t9棘突为中心取背部后正中切口，长约3 cm，依次切开皮肤、皮下组织，显露t8～t10棘突及椎板。轻轻咬除t9节段棘突和两侧椎板，打开椎管至椎弓根部，暴露脊髓约8 mm。以t9相对区域为损伤区，后正中血管为中心，使用重30 g,接触面积4 mm2重物垂直压迫脊髓10 min。实验动物随机分为3 组：（1）正常对照组(n =6只)：未行任何处置；（2）dmem组（n =18只）：脊髓损伤区周围注射dmem；（3）bmscs组（n =18只）：脊髓损伤区周围注射bmscs。

1.4 骨髓基质细胞移植

损伤30 min后，通过立体定位仪，用微量注射器接无菌玻璃拉丝针头将bmscs悬液缓慢注入到距脊髓损伤区头、尾侧各1.0 mm，距中线0.5 mm脊髓实质内。注射深度分别是1.75、1.25、0.75 mm。每点3 μl(75 000个细胞)，每只动物移植的细胞总数共3.0×105个细胞，注射时间5～10 min，为防止细胞倒流留针5 min。依同样方法dmem组注射等量dmem培养液。术后每日2 次膀胱按摩排尿，1 周内每日腹腔注射抗生素。

1.5 tunel原位末端标记

3 组试验动物分别在术后3、7和14 d取材，正常对照组每次取材2 只，其余两组每次取材6 只。麻醉下经左心室灌注生理盐水后用4％冷多聚甲醛灌流固定，完整取出以t为中心的脊髓节段（长约1.5 mm）。多聚甲醛后固定过夜后，石蜡包埋。对距离损伤区头、尾侧各1～2 mm的脊髓组织切片后进行细胞凋亡检测，按细胞凋亡检测试剂盒说明书程序操作。阳性对照：在标记反应前用dna酶消化；阴性对照：标记反应液省去末端脱氧核苷酸转移酶(tdt)。光镜下观察，细胞核中有棕黄色颗粒者为阳性细胞，即凋亡的细胞。在高倍光镜下,计算凋亡指数，即每张切片选取5个阳性细胞数最多的高倍视野，计算出平均阳性细胞百分数。

1.6 统计学方法

所得数据以均数±标准差（±s）表示，采用spss13.0统计软件做统计分析，组间比较采用重复测量方差分析，p<0.05表示差异具有显著性意义。

2 结果

2.1 骨髓基质细胞培养

原代培养24 h后，可见少量细胞贴壁生长，形态为圆形，72 h左右，细胞开始增值并形成细胞集落，细胞常围绕集落中央呈岛状向四周分布，细胞形态多样，多为扁平多角形、三角形或梭形，7～14 d细胞达到90%融合形成单层细胞层。传代后，细胞增值速度加快，3～5 d即可长满培养瓶底，随着传代代数的增加，细胞形态多较均一为长梭形，并呈漩涡或平行状排列生长（图1）。

2.2 tunel原位末端标记检测结果

正常对照组脊髓组织偶见零星tunel阳性细胞。脊髓损伤后，dmem组和bmscs组阳性细胞数量均明显增加，于术后3 d阳性细胞数最多达高峰，其后随时间延长逐渐减少。阳性细胞分布于脊髓灰质和白质内，但以白质内神经细胞为主。术后3、7和14 d，bmscs组tunel阳性细胞的数目明显少于dmem组(表1、图2、3)。

表1 各组大鼠术后不同时间点损伤周围区脊髓内神经细胞的凋亡指数（略）

与正常对照组比较，#p<0.05；##p<0.01，与dmem处理组比较，*p<0.05

3 讨论

干细胞作为移植物治疗脊髓损伤显示出独特的希望，因为他们可以做为支持轴突再生的桥梁并且可以分化成神经元或神经胶质细胞，从而替代损伤的内源性神经细胞。而存在于成体骨髓内的多潜能成体干细胞在体外培养过程中给予适当的处理能够产生神经胶质样和神经元样细胞，并且在体内能够分化成神经胶质细胞样，少突胶质细胞样细胞，同时一些细胞能够表达未成熟神经元标志物［3］。脊髓损伤是一破坏性的神经系统损伤，由于脊髓神经元和轴突的丧失而导致功能缺陷。近年来，许多注意力集中于继发性损伤，因为继发性损伤表现出对治疗干预更敏感。原发性脊髓损伤后出现一系列神经毒性事件称为继发性损伤，其包括：局部炎症反应和细胞凋亡。细胞凋亡是急性脊髓损伤后神经细胞的主要死亡形式，也是加重脊髓损伤的一个重要因素。早期为神经元出现凋亡，接下来主要是退变的白质传导束中的少突胶质细胞发生延迟的凋亡。

当前脊髓损伤研究大多集中在利用bmscs的再生潜能，通过替代损伤的神经元和少突胶质细胞以获得功能恢复。但是研究显示只有很小比例的bmscs分化为神经实质细胞表型。有的研究者还发现，bmscs移植后促进脊髓损伤大鼠的运动功能恢复，但并没有检测到bmscs向神经细胞分化［4］。因此，认为bmscs移植促进脊髓损伤后神经功能改善不能完全用替代死亡和损伤的神经细胞来解释，其他的作用机制可能参与sci的修复。

本研究结果显示，脊髓损伤后，损伤区周围脊髓灰质和白质中的凋亡细胞数量明显增加，这提示脊髓损伤后，损伤周围存在大量的神经细胞凋亡，凋亡所导致的神经细胞死亡是扩大脊髓损伤范围的一个因素。同时，还发现脊髓损伤3天后，凋亡细胞以白质内神经细胞为主，而白质内存在的主要神经细胞为形成髓鞘的少突胶质细胞，这说明凋亡在脊髓损伤中、远期慢性脱髓鞘过程中起着重要作用。在本研究，bmscs组凋亡的神经细胞数目明显少于dmem组，这提示脊髓损伤后局部移植bmscs能够抑制损伤周围组织内神经细胞的凋亡。这一发现与venkata 等人的研究结果相一致［5］。我们推测bmscs抑制神经细胞凋亡的可能机制包括：（1）bmscs通过产生直接对神经细胞具有营养和保护作用的细胞因子和营养因子，保护损伤脊髓组织内的神经细胞免受或逆转脊髓继发损伤所导致的伤害。因为，以往研究表明bmscs能够刺激受体组织分泌及自身分泌一系列具有保护和营养神经细胞作用的生长因子和营养因子［6-8］，例如：脑源性神经营养因子（bdnf）,神经生长因子（ngf）和血管内皮生长因子（vegf）。此外，我们前期实验亦证实，脊髓损伤后移植bmscs能够上调损伤脊髓组织内vegf表达［1］4116。而体外和体内试验证实，应用外源性vegf能够抑制神经细胞的凋亡［9］。（2）bmscs在损伤的脊髓组织中下调诱导细胞凋亡的细胞因子。以往试验表明应用外源性vegf或bmscs移植能够显著下调脊髓损伤后神经元和少突胶质细胞表达诱导细胞凋亡的caspase-3［5］2080-2093。而caspase-3是凋亡过程中最重要的半胱氨酸蛋白酶，是多种凋亡途径的共同下游效应部分，是细胞凋亡蛋白酶级联反应的必经之路。因此，我们推测，bmscs修复脊髓损伤的机制之一可能是通过上调损伤脊髓内vegf的表达及下调caspase-3而抑制神经细胞的凋亡，进而减轻脊髓原发损伤后的继发损伤。 【参考文献】

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