山东桔梗多倍体诱导与鉴定
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摘 要：在离体培养条件下，比较了单用不同浓度秋水仙素和0.2%秋水仙素与不同浓度二甲基亚砜（DMSO）混用对山东桔梗愈伤组织诱导多倍体的效果。结果表明：用0.2%秋水仙素和2% DMSO浸泡山东桔梗愈伤组织16 h，多倍体诱导率最高，达43.3%。桔梗多倍体植株叶颜色深、有皱褶，叶片大且厚，茎秆粗壮，节间距长。经显微鉴定，多倍体叶气孔增大，但单位面积气孔数目减少。
关键词：桔梗；秋水仙素；二甲基亚砜；多倍体诱导
中图分类号：S567.239.035.2 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2013）10-0032-03
桔梗[Platycodon grandiflorum （Jacq.）A.DC.]为桔梗科多年生草本植物，主要分布于山东、内蒙、安徽等地，是一种药食赏三用的极具开发利用价值的经济作物，为我国传统大宗药材，以干燥根入药，具有宣肺、祛痰、排脓之功效[1]。山东桔梗以“根直、条白、质优”等显著特点备受韩国、日本等国外市场的青睐。随着桔梗国外市场需求量的持续增加，作为“桔梗之乡”的山东省淄博市博山区已成为全国桔梗交易的集散地。本课题组对该区域桔梗的商品性状和品质经过十多年的追踪调研发现，目前在生产中普遍存在桔梗品种缺乏、农家种种性退化等现象。鉴于此，本课题组采用空间隔离去除杂化、异化植株的方法，对农家种进行群体改良，选育出鲁梗1号和鲁梗2号桔梗新品种[2，3]。两个品种因产量高、质量优，在山东省得到较快推广种植。
桔梗多倍体产量、皂甙含量都显著高于二倍体[4]。为此，在群体改良选育新品种的同时，对桔梗多倍体诱导技术进行了探讨。本试验采用秋水仙素添加到培养基和秋水仙素与二甲基亚砜（DMSO）相结合的复合诱变技术对本课题组自育品种进行了多倍体诱导，旨在丰富桔梗种质资源，为今后的品种选育奠定基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
山东桔梗为自选优良种质。
1.2 试验方法
1.2.1 愈伤组织的培养 参照陈庆亮等[1]的培养方法，从田间采摘桔梗幼嫩主茎或侧枝，中性洗涤液刷洗后，流动自来水冲洗0.5 h，吸干水分，75%酒精表面灭菌30 s，无菌水冲洗5次，0.1% HgCl2消毒10 min，无菌水冲洗5次，切成0.5～1 cm的小段，每段带1个腋芽，接种于MS+0.5 mg/L BA +0.1mg/L IAA培养基上，25℃、16 h/d光照条件下培养。
1.2.2 多倍体诱导 ①秋水仙素处理：在培养基MS+0.5 mg/L BA +0.1 mg/L IAA中添加秋水仙素，使其终浓度分别为0、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%，愈伤组织接种于该培养基上诱导培养。
②秋水仙素和DMSO处理：愈伤组织用0.2%秋水仙素和浓度分别为0、1%、2%、5%的 DMSO浸泡16 h，以去离子水为对照，无菌水冲洗3次，然后接种于MS+0.5 mg/L BA +0.1 mg/L IAA培养基上培养。
①和②处理，均培养30 d，重复3次。
1.2.3 生根培养 将①和②处理得到的各株系于l/2MS+0.5 mg/L IAA+0.5 mg/L PP333+0.1mg/L ABT培养基上诱导生根。
1.2.4 多倍体鉴定 参照王小华等[5]的研究，利用气孔鉴定法对多倍体幼苗进行鉴定。 待经①和②处理得到的试管苗长出2～3轮叶片后，撕取其叶下表皮制片，用显微镜观测气孔大小及单位面积内气孔的数量，并拍照。
1.2.5 炼苗与移栽 炼苗：30 d后将培养瓶置于室外，拧松培养瓶盖，3 d后瓶盖完全拧松，但不要取下。移栽：炼苗7 d后用镊子将幼苗从培养瓶中取出，轻轻去除根部琼脂，移入蛭石和草炭土（1∶1）的营养土中。移栽后7 d内，每天喷雾2 h，保持营养土水分。待植株足够健壮时，移栽至田间。
2 结果与分析
2.1 多倍体诱导
由表1可知，在0～0.6%浓度范围内，随着培养基中秋水仙素浓度增加，多倍体诱导率升高，成活率降低；当秋水仙素浓度为0.6%时，多倍体诱导率最高，达37.5%，成活率为52.5%；当秋水仙素浓度升高到0.8%时，多倍体诱导率降低到20.0%，成活率也减少为22.5%。可见，在一定浓度范围内，随着秋水仙素浓度的增加，多倍体诱导率提高，最适浓度为0.6%，大于该浓度诱导率降低；成活率随着秋水仙素浓度升高而降低。
从表2可知，仅用0.2%的秋水仙素浸泡时，多倍体诱导率最低，为6.7%，愈伤组织存活数最高，为27个；当用0.2%秋水仙素和2% DMSO浸泡时，多倍体诱导率最高，达43.3%，但愈伤组织存活数只有18个。可见，DMSO和秋水仙素共同作用提高了桔梗多倍体诱导率，但成活率降低。最佳诱导组合为0.2%秋水仙素和2% DMSO。
2.2 生根培养
30 d后切取生长一致、2.5 cm以上的壮苗接种于生根培养基上培养18 d后，底部形成7～9根乳白色的根系。表明，该培养基配方有利于山东桔梗试管苗生根。
2.3 多倍体鉴定
由图1和表3可知，山东桔梗多倍体叶下表皮的气孔平均长直径和短直径分别为10.2 μm和6.3 μm，而二倍体分别为5.9 μm和3.5 μm；多倍体气孔面积是二倍体的3倍多，但多倍体单位面积气孔数减少。可见，从气孔密度和气孔大小上看，多倍体与二倍体均有明显区别。
2.4 多倍体幼苗农艺性状
移栽14 d后，与二倍体相比，多倍体在叶片颜色、厚度、茎粗和节距等方面有明显变化。多倍体植株叶片颜色变深，叶面出现明显皱褶，叶片厚度增加，茎粗增加，节距增长，生长旺盛（图2）。
3 讨论
不同的外植体诱导多倍体，诱导率的高低与秋水仙素的浓度和处理方法有关系。王小华等[5]以桔梗茎段为材料，采用秋水仙素浸泡的方法诱导多倍体，结果表明，以含0.1%秋水仙素处理40 h后诱导率最高，可达50%。鉴于愈伤组织增生速度显著高于丛生芽增生速度，本试验以桔梗茎段产生的愈伤为材料，采用秋水仙素添加到培养基上的方法诱导多倍体，更具有实际应用和推广价值，结果显示，含0.6%秋水仙素的培养基诱导率最高，可达37.5%。
关于利用秋水仙素和DMSO诱导多倍体变异，在其它作物研究上报道较多，但在桔梗研究上尚未见报道。王凤宝等[6]研究表明，0.05%秋水仙素和2%DMSO混合水溶液间歇处理甘薯种子24 h，多倍体诱导效果较好。张旺凡等[7]利用2%DMSO混合不同浓度的秋水仙素处理黄精，诱导率低，但是变异株倍性稳定性较好，整倍率较高。刘亚娟[8]采用0.05%秋水仙素和2%DMSO处理百合鳞片，诱导率达到86%。本试验用0.2%的秋水仙素和2%的DMSO混合处理桔梗愈伤组织，诱导率达到43.3%，且倍性稳定性好，变异明显。
本研究以桔梗愈伤组织为诱变材料，采用秋水仙素添加到培养基、秋水仙素和DMSO相结合的复合诱变技术，首次探明山东桔梗诱导多倍体的条件和方法，缩短了其育种进程，获得了桔梗多倍体育种材料，为桔梗倍性育种提供了丰富的种质资源。
参 考 文 献：
[1] 陈庆亮， 单成钢， 朱彦威， 等. 桔梗不育系的组织培养和快速繁殖技术研究 [J]. 北方园艺， 2010，6：142-144.
[2] 朱彦威， 单成钢， 倪大鹏， 等. 桔梗新品种鲁梗1号的选育及栽培技术 [J]. 山东农业科学， 2009，1：115-116.
[3] 朱京斌， 陈庆亮， 单成钢， 等. 桔梗新品种鲁梗 2 号的选育及栽培技术要点 [J]. 山东农业科学， 2012， 44（7）：127-128.
[4] 彭向东， 高山林， 朱丹妮. 桔梗同源四倍体株系的鉴定和桔梗皂甙D含量的比较 [J]. 药物生物技术， 2004， 11（6）：351-355.
[5] 王小华， 熊 丽， 屈云慧， 等. 中国桔梗多倍体诱导与鉴定 [J]. 云南植物研究， 2006， 28（6）：593-598.
[6] 王凤宝， 付金峰， 董立峰， 等. 秋水仙素和二甲基亚砜诱变选育短蔓型甘薯新品种短蔓3号 [J]. 2008， 22（2）：169-174.
[7] 张旺凡， 冯务群， 晁 志， 等. 黄精多倍体诱导初报 [J]. 中国种业， 2011，1：48-49.
[8] 刘亚娟. 百合（Lilium spp.）离体快繁及多倍体育种研究 [D]. 重庆： 西南大学， 2009， 27-31.