珍珠贝遗传特征及其应激表达

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组织蛋白酶 D( cathepsin D，CTSD) 属于天冬氨酸蛋白酶( EC 3. 4. 23. 5) ，广泛存在于生物界当中，具有多种生物功能。在哺乳动物中发现 CTSD与抗原呈递有关并具有抗病抗逆作用［1］，在鲶鱼( Parasilurus asotus) 、日本鳗鲡( Anguilla japonica) 、泥鳅( Misgurnus anguillicandatus) 和虹鳟( Oncorhyn-chus mykiss) 中发现 CTSD 前体与抗菌肽 Parasin I 的形成有关［2］，在巨噬细胞中具有降解病原体的作用［3］，还能够降解内涵体中的蛋白质，如血红蛋白、血清白蛋白和肌红蛋白等［4］。此外还发现在鱼类中该酶参与性腺发育、饥饿与迁移过程中肌肉内蛋白质的降解［5］。到目前为止，许多物种的组织蛋白酶基因序列已在 GenBank 中登录，包括哺乳动物、鸟类、鱼类、节肢动物的昆虫和甲壳动物，但软体动物双壳类中仅报道了栉孔扇贝( Chlamys farreri) 和大珠母贝( Pinctada maxima) 的组织蛋白酶 D 基因［6 －7］，以及合浦珠母贝( P. fucada) 的组织蛋白酶 L1、L2基因［8 －9］，其他珍珠贝的组织蛋白酶基因尚未见报道。企鹅珍珠贝( Pteria penguin) 是一种热带、亚热带的大型海产经济双壳贝类，主要分布于中国的广东、广西、海南、台湾沿海以及日本九州的南部、琉球群岛直至菲律宾等地，具有生长快、个体大、生命力强和珍珠质分泌旺盛的特点，可用于培育附壳珠和大型游离珍珠。该研究克隆了企鹅珍珠贝组织蛋白酶 D 的 cDNA 序列，并对其在脂多糖( LPS)和哈维弧菌( Vibrio harveyi) 刺激下的组织应激表达特征进行了初步研究，以期为进一步探究其抗病抗逆机理奠定基础，为珍珠贝类抗逆育种提供理论依据。

1 材料与方法

1. 1 总 RNA 提取和 cDNA 合成

企鹅珍珠贝取自海南三亚，壳长 5. 98 ～ 8. 37cm，体质量 10. 12 ～ 28. 44 g，于 25 ～ 27 ℃ 充气海水中暂养 1 周后取肝胰脏组织快速保存于 RNA 样品保存剂( Takara) 中，参照 Trizol( Invitrogen) 说明书提取总 RNA。用紫外分光光度计测量光密度OD260 nm和 OD280 nm，以确定 RNA 的浓度和纯度。然后用 M-MLV 逆转录酶( Takara) 合成一链 cDNA，反应体系为 RNA 1 μg，Oligo-dT( 50 μmol?L－ 1) 1μL，加 RNase free dH2O 至 6 μL，70 ℃ 保温 10 min后冰上急冷 2 min 以上; 在上述混合液中加入 5 ×M-MLV 缓冲液 2 μL，dNTPs ( 10 mmol?L－ 1) 0. 5μL，RNase Inhibitor 10 U， M-MLV 200 U， 加RNase free dH2O 至 10 μL，42 ℃ 保温 1 h，70 ℃ 保温 15 min 后冰上冷却， －20 ℃保存。

1. 2 全长 cDNA 的克隆与测序

基因克隆方法参照黄桂菊等［10］，所用引物见表 1。用笔者实验室的大珠母贝组织蛋白酶 D 简并引物 pmCTSDF1、pmCTSDF2 扩增企鹅珍珠贝的中间片段，PCR 反应总体积为 20 μL，包括单链 cD-NA 0. 5μL、dNTPs 0. 2 mmol?L－ 1，引物各 1 μmol?L－ 1、MgCl24. 0 mmol?L－ 1、10 × buffer 2 μL 和 Taq酶 0. 5 U。PCR 扩增程序为 94 ℃ 5 min，35 个循环; 94 ℃ 30 s，48 ℃ 30 s; 72 ℃ 1 min，72 ℃ 10min。根据扩增 得 到 的 中 间 片 段 设 计 特 异 性引物pgCTSD 3' F1、 pgCTSD 3' F2 和 pgCTSD 5' R1、pgCTSD 5' R2( 表 1) 用于 RACE PCR。3'RACE: 用引物 pgCTSD3' F1 和 Adaptor 进行第一轮扩增，除引物外反应体系与中间片段克隆的相同，反应程序为 94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，53 ℃30 s，72 ℃ 1 min 30 s，35 个循环; 72 ℃ 10 min，将第 一 轮 PCR 产 物 稀 释 50 倍 作 为 模 板，以pgCTSD3' F2 和 Adaptor 为 引物进 行第 二 轮 扩增，反应体系同上，反应程序为 94 ℃ 5 min，94 ℃ 30s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min 20 s，35 个循环; 72 ℃10 min。5'RACE: 采用加尾法，用 PCR 产物纯化试剂盒纯化回收 cDNA 第一链，然后用末端转移酶 TdT在第一链 cDNA 3'端加上 poly( C) 尾作为第一轮PCR 扩增的模板，用 Oligo dG 和 pgCTSD 5' R1 引物，反应体系同 3' RACE，反应程序为 94 ℃ 5min，94 ℃ 30 s，53 ℃ 30s，72 ℃ 1 min，35 个循环; 72 ℃ 10 min。将第一轮 PCR 产物稀释50 倍作为模板，用 Oligo dG 和 pgCTSD 5' R2 进行第二轮PCR 扩增，除引物外反应体系同上，反应程序为94 ℃ 30 s，51 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35 个循环;最后 72 ℃ 10 min。中间片段产物和 RACE 产物经电泳后切胶回收，将回收产物克隆到 pMD-18T 载体中，转化至大肠杆菌 DH5α，经菌液鉴定后送往上海生工公司测序。

1. 3 序列特征分析

将 5'RACE 片段、中间片段和 3'RACE 片段序列进行拼接，然后用 DNAStar 软件预测氨基酸序列; 分别用 SingalP 3. 0( http: ∥www. cbs. dtu. dk/services / SignalP) 、Prosite ( http: ∥ www. expasy. ch /prosite) 、PredictProtein 的 PHD( http: ∥www. predic-tprotein. org / ) 和 Swiss( http: ∥swissmodel. expasy. or-g / ) 软件预测信号肽、蛋白结构域和三级结构; 用NCBI 中的 BLASTp 搜索同源蛋白，然后用 ClustalX进行多序列比对，用 MEGA 3. 1 软件重建系统发育进化树。

1. 4 LPS 和弧菌刺激试验

试验于 2010 年 5 月在海南三亚南海水产研究所热带水产研究开发中心进行。企鹅珍珠贝经水泥池驯养后用于试验，设空白对照组、处理对照组、LPS 刺激组和哈维弧菌刺激组，各组 3 个重复，每个重复用 3 个贝。空白对照组不做任何处理; 处理对照组闭壳肌注射 200 μL PBS; LPS 刺激组: 取LPS 溶解于 PBS 中，使 LPS 终质量浓度达 10 μg?mL－ 1，闭壳肌内注射 LPS 200 μL; 弧菌刺激组:哈维弧菌经 2216E 液体培养基扩大培养后离心收取菌液，平板计数法计数后用 PBS 悬浮哈维弧菌，使 OD600 nm= 0. 4，闭壳肌内注射 200 μL 悬液哈维弧菌。6 h 后取 4 组企鹅珍珠贝的闭壳肌、性腺、肝胰脏、外套膜和鳃组织保存于 RNA 样品保存剂中，带回实验室用于表达分析。

1. 5 组织表达分析

参照 Trizol( Invitrogen) 说明书提取闭壳肌、性腺、肝胰脏、外套膜和鳃组织的总 RNA，并检测其浓度和纯度。用 RQ1 RNase-free DNase 消化总RNA 样品中的 DNA。用 PrimeScriptTM1stStrand cD-NA Synthesis Kit( Takara) 试剂盒合成一链 cDNA 用于荧光定量表达分析。根据 pgCTSD 的 cDNA 序列设计特异性引物 pgCTSD F 和 pgCTSD R( 表 1) 。PCR 反 应 体 系 为 20 μL: 2 × SYBR Premix ExTaqTM 10 μL，1 μL cDNA，0. 4 μmol?L－ 1引物( 10μmol?L－ 1) ，8. 6 μL 双蒸水，每个样品设置 3 个PCR 重复，β-actin 基因为内参基因［11］，引物序列见表 1。反应程序为 95 ℃ 2 min，95 ℃ 15 s，57℃ 15 s，72 ℃ 30 s，40 个循环; 之后进行溶解曲线( melting curve) 分析，以确定 PCR 反应的特异性。采用相对法 CT( 2－ ΔΔCTmethod) 分析 pgCTSD 的组织表达水平，ΔCT 为目的基因 CT 值与内参基因CT 值的差值，以空白对照组闭壳肌的 ΔCT 为基准，与其他各组的 ΔCT 的差值为 ΔΔCT，最后用公式 2－ ΔΔCT计算相对表达量。用 GraphPad Prism 5. 0软件进行空白对照组和处理对照组间、处理对照组和刺激试验组间的 t 检验分析。

2 结果

2. 1 pgCTSD 的序列分析

将 5'RACE 片段( 355 bp) 、中间片段( 376 bp)和 3'RACE 片段( 1 347 bp) 进行拼接得到1 767 bp 的全长 cDNA 序列( 图1) ，命名为 pgCTSD( P. Penguincathepsin D，GenBank 登录号: HM989013) ，其中5'UTR 为 38 bp，3'UTR 为 553 bp，ORF 1 176 bp，编码 392 个氨基酸，包括信号肽( Met1-Ala18) 、前体域( Leu19-Lys47) 和成熟域( Tyr48-Ser392) ，分子量为 42. 3 kDa，等电点为 8. 04。pgCTSD 一级结构包含 2 段天冬氨酸蛋白酶签名序列( Val84-Val95和Ala272-Gly283) 、2 个 N-连接的糖基化位点( Asn124和Asn237) 和 1 段非消化性组织蛋白酶 D 的特征序列( DVPPPNGP) 。

2. 2 pgCTSD 的同源性比较和系统发生分析

pgCTSD 与 大 珠 母 贝 的 pgCTSD 相 似 性 最 高( 79%) ，与栉孔扇贝的相似性为 75%，与其他物种的相似性为 59% ～ 75% ( 表 2) 。非消化性组织蛋白酶 D 的特征序列与其他物种相似，序列都符合 DxPxPxA/GP 氨基酸排列顺序［12］。NJ 树表明，组织蛋白酶 D 分为 2 支，一支包括哺乳动物、鸟类与鱼类; 另一支包括节肢动物和软体动物。其中大珠母贝、企鹅珍珠贝和栉孔扇贝聚成一小支( 图 2) 。

2. 3 pgCTSD mRNA 组织表达与应激表达特征分析

未进行任何处理的空白对照组中 pgCTSD mR-NA 在闭壳 肌、性 腺、肝 胰 脏、外 套 膜 和 鳃 组 织中都有表达，且在闭壳肌中最少，肝胰脏中表达量最高，2－ ΔΔCT值分别为 1 和 197. 4( 图 3 － a 和图3 － b，空白组) 。处理对照组注射 PBS 6 h 后肝胰脏在各 组 织 中 仍 保 持 最 高 表 达 量 ( P ＞ 0. 5) ，2－ ΔΔCT值为 160. 8，与空白对照组相比，闭壳肌和性腺的表达量显著上升( P ＜ 0. 1) ，2－ ΔΔCT值分别为 1. 9 和 55. 3，肝胰脏有所下降，外套膜和鳃组织显著下降( P ＜ 0. 1) ，2－ ΔΔCT值分别为 31. 6 和24. 0( 图 3 － a 和图 3 － b，PBS 组) 。试验组注射LPS 6 h 后，除性腺外各组织表达量相差不大，外套膜最高，2－ ΔΔCT值为 30. 6，与处理对照组相比，闭壳肌的表达量显著上升( P ＜ 0. 1) ，2－ ΔΔCT值为19. 2，性腺和肝胰脏显著下降( P ＜ 0. 1) ，2－ ΔΔCT值为 0、25. 4，外套膜和鳃组织变化不显著( 图 3－ a，LPS 组) 。弧菌刺激 6 h 后性腺的表达量在各组中最高，2－ ΔΔCT值为 56. 9，与对照组相比，闭壳肌和鳃组织的表达量显著上升( P ＜ 0. 1) ，2－ ΔΔCT值为 13. 3 和 42. 7，肝胰脏和外套膜显著下降( P ＜0. 1) ，2－ ΔΔCT值为 26. 4 和 9. 6，性腺无显著变化( 图 3 － b，弧菌组) 。

3 讨论

此研究获得的企鹅珍珠贝 pgCTSD 与其他组织蛋白酶 D 一样是由信号肽、前体域和成熟域三部分组成，其中信号肽长 18 个氨基酸残基，与大珠母贝相同［7］，而美国龙虾( Homarus america-nus)［13］和金鲷( Sparus aurata)［14］分别为 16 个和19 个，人类［15］和猪［16］均为 20 个，物种间存在较大差异。在 N-糖基化位点数量方面，企鹅珍珠贝pgCTSD( 2 个 ) 与 大 珠 母 贝［7］相 同，与 虹 鳟 ( 1个)［17］、美国龙虾 CTSD1( 3 个)［13］、金鲷［14］( 3个) 等不同。在所分析的物种中企鹅珍珠贝的pgCTSD 与大珠母贝 pgCTSD 的一致性最高，亲缘关系最近，与传统分类关系相符。

正常情况下企鹅珍珠贝 pgCTSD 在肝胰脏、鳃和外套膜中的表达量较高，其中在肝胰腺中最高，与栉孔扇贝、大菱鲆一致［18 －19］，但在 LPS 和弧菌刺激后相对表达量的变化情况不同。在肝胰腺中与正常表达量相比，PBS 和 LPS、弧菌刺激都引起表达量下降，但 LPS 和弧菌刺激后的表达量比 PBS刺激和正常情况的表达量低很多，可能是因为产生了大量应激蛋白［19］，导致 CTSD 表达的延迟，而LPS 和弧菌又消耗了大量 CTSD，因此 CTSD 表达量大幅下降。在大菱鲆和栉孔扇贝［18 －19］中也发现类似情况，表明组织蛋白酶参与了免疫反应，肝胰腺是贝类重要的免疫器官。大菱鲆在弧菌刺激后CTSD 在肝胰脏的表达水平经历了下降、上升、再下降又上升的过程［19］，而笔者只检测了企鹅珍珠贝刺激 6 h 后 pgCTSD 在肝胰脏中的表达变化，其时空表达模式还有待进一步研究。LPS 和 哈 维 弧 菌 刺 激 企 鹅 珍 珠 贝 6 h 后pgCTSD 表达情况有所不同，前者性腺表达量显著下降，外套膜和鳃组织中无显著变化; 后者性腺无明显变化，外套膜显著下降，鳃组织显著上升。两者表达情况的差异可能与刺激物成分不同有关。LPS 是革兰氏阴性菌 ( Gram-negative bacteria) 的细胞壁成分，组成比较单一，而哈维弧菌包含多种致病因子，如胞外蛋白( OMP) 、LPS 和胞外产物( ECP) 等。虽然 LPS 能刺激多种细胞因子的表达［20］，但对大黄鱼( Pseudosciaena crocea) 的研究表明，单一成分的 LPS 的致病性比哈维弧菌弱［21］。表明企鹅珍珠贝 CTSD 对不同致病成分的表达反应有所不同。

企鹅珍珠贝性腺 CTSD 表达量很低，而大珠母贝性腺的正常表达量很高甚至比肝胰脏还高［7］，它们可能处于不同的性腺发育时期或种间存在差异。在栉孔扇贝中也发现性腺的表达量较高，而在弧菌刺激后显著下降［18］，其所用栉孔扇贝也为成熟个体。在虹鳟中 CTSD 在卵巢不同发育时期表达量也不同，甚至精巢和卵巢的表达量也不同［17］，表明 CTSD 对性腺发育具有一定作用。