紫草素诱导细胞凋亡及凋亡信号途径研究进展
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摘要：细胞凋亡又称程序性细胞死亡，是指细胞为维持内环境稳态由基因控制的自主有序性死亡。细胞凋亡主要通过内质网、线粒体和死亡受体3种途径介导。紫草素是一类萘醌类化合物，为中药紫草的主要有效成分之一，具有多种生理活性，其抗肿瘤功效是目前研究热点。紫草素抗肿瘤机制与3种细胞凋亡信号途径密切相关。本文就紫草素诱导细胞凋亡及细胞凋亡信号途径的研究进展作一综述。
关键词：紫草素；细胞凋亡；信途径；综述
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.03.031
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2017）03-0125-05
Research Progress in Cell Apoptosis Induced by Shikonin and Signal Pathway of Apoptosis XIE Yu， HOU Xiao-long， WU Chun-lian （College of Life Science of China West Normal University， Key Laboratory of Southwest China Wildlife Resources Conservation of Ministry of Education， Nanchong， 637009， China）
Abstracts： Apoptosis， also known as programmed cell death， is a gene controlled active cell suicide process in order to maintain balance of organisms. Apoptosis is mainly mediated through three signal pathways， including the endoplasmic reticulum， mitochondria， and death receptor. As a kind of naphthoquinone compounds and one of the main active ingredients of Lithospermum， shikonin has many biological activities， and its anti-cancer research is recent hot spot. The anti-cancer mechanism of shikonin is closely related with apoptosis and three kinds of signaling pathways. This article reviewed the research progress in apoptosis and signal pathways induced by shikonin.
Key words： shikonin； apoptosis； signal pathway； review
紫草Arnebiae Radix为紫草科植物新疆紫草Arnebia euchroma （Royle） Johnst.或内蒙紫草Arnebia guttata Bunge的干燥根。紫草素是一类萘醌类化合物，为紫草的主要有效成分之一，具有抗病毒[1]、抗氧化[2]、抗炎[3]、加速伤口愈合和增强免疫[4]等功效。其中紫草素的抗肿瘤作用是目前研究的热点，而该作用主要通过诱导细胞凋亡实现。本文就紫草素诱导细胞凋亡的生物学功能及细胞凋亡的信号途径作一综述。
1 细胞凋亡
细胞凋亡又称细胞程序性死亡，是由基因决定的自主性的细胞死亡过程。细胞凋亡与生物的多种生命活动都有着十分密切的联系。细胞凋亡异常会导致肿瘤的发生。细胞凋亡与肿瘤的治疗有着密切的联系[5]，多种化疗药物的作用机理都与诱导细胞凋亡有关[6]。
基金项目：中国博士后科学基金（2013M540391）；四川省教育厅重大培育项目（13CZ0029）；三峡库区生态环境与生物资源省部共建重点实验室开放课题基金项目（SKL-2011-05）
通讯作者：伍春莲，E-mail：
细胞发生凋亡时会伴随相应的分子和细胞结构水平的变化，如DNA的降解，相关蛋白和酶的异常表达，并伴Ca2+的释放，还伴随有细胞膜、线粒体膜通透性改变以及细胞骨架松散等现象[7]。
2 紫草素诱导的细胞凋亡
自1999年Hashimoto发表β羟基异酰紫草素抑制多种癌细胞的生长并诱导白血病HL60细胞凋亡研究报告以来，出现大量紫草素诱导细胞凋亡相关研究成果。Gao D等[8]通过电子旋转发现紫草素能与谷胱甘肽和其他氧化胁迫相关的复合物相互作用，最终诱导HL60细胞凋亡。Hou Y等[9]采用MTT比色法和流式细胞技术研究发现，紫草素可体外诱导MCF-7细胞凋亡。Calonghi N等[10]发现紫草素可通过抑制细胞外表皮生长因子受体诱导结肠癌细胞凋亡。Yeh C C等[11]发现紫草素能诱导膀胱癌T24细胞凋亡。Min R等[12]发现紫草素能抑制口腔鳞癌Tca8113的增殖，并诱导其凋亡。Ying kun N等[13]发现紫草素能诱导人类肝癌HepG2细胞凋亡。自2003年起，国内逐步开始紫草素诱导细胞凋亡相关研究，如王禾等[14]研究紫草素对细胞凋亡的影响，表明紫草素是可以诱导角质形成层细胞的凋亡。2004年，以吴振为代表的学者们开始对紫草素诱导肿瘤细胞凋亡的广谱性进行研究，包括角质形成层细胞、黑色素瘤A357-S2、宫颈癌HeLa[15]、膀胱癌细胞T24[16]、白血病细胞K562[17]、生殖系肿瘤细胞[18]、HL60[19]等，表明紫草素能诱导多种癌细胞凋亡。
3 紫草素诱导细胞凋亡的信号途径
Hsu P C等[20]发现p53、p27、Bcl-2家族以及细胞色素c（Cyt c）的释放，都与紫草素诱导的细胞凋亡有联系。同年，Wu Z等[15]发现紫草素通过Caspase-9参与调控由p53介导的细胞周期的阻断，引起细胞凋亡。2007年，Yeh C C等[11]发现紫草素诱导的细胞凋亡与Caspase-3相关。2008年Mao X等[21]发现紫草素通过ROS/JNK通路诱导细胞凋亡。2009年以后，研究者们开始研究其他药物和紫草素的联合作用，以及紫草素会产生的一些耐药性，并取得了一些新进展。Han D W等[22]发现Nec-1能够将紫草素诱导的坏死性细胞凋亡转换为细胞凋亡，用Nec-1处理紫草素作用后的HL60细胞，细胞凝结现象和Caspase活性均增强，表明Nec-1能够强化由紫草素诱导的细胞凋亡。Zhang F L等[23]发现紫草素和拓扑替康联合作用，能诱导胶质瘤细胞凋亡。Wu H等[24]发现紫草素处理后癌细胞只产生了很低的抗性，并通过基因表达分析，紫草素产生较低的抗性和上调β微管蛋白相关。Hu X等[25]也发现凋亡诱导药物作用在癌细胞上会产生一定的抗性，但这些细胞对紫草素诱导的坏死性细胞凋亡十分敏感。他们还提出紫草素与其他抗肿瘤药物搭配，会克服单一药物作用在癌细胞上产生的抗性。
3.1 经线粒体诱导的细胞凋亡途
线粒体途径是细胞凋亡的三大途径之一，线粒体膜的通透性降低、线粒体失活都将会导致细胞凋亡。线粒体途径与Cyt c、凋亡诱导因子（AIF）、ROS、Bcl-2、p53等分子有密切的关系。紫草素在线粒体途径中通过作用于细胞内的Bcl-2、p53，并促使细胞内产生ROS进而诱导细胞凋亡。
3.1.1 诱导产生活性氧引发细胞凋亡 紫草素可以诱导细胞产生ROS、谷胱甘肽（GSH），并诱导细胞凋亡。当清除细胞内ROS后，紫草素诱导的细胞凋亡受到明显抑制，这表明ROS的产生与紫草素诱导的细胞凋亡有关。在产生ROS后，进一步产生高活性的自由基，使细胞的蛋白质、脂质、DNA结构、线粒体膜遭到氧化性破坏，促进Cyt c的释放，引发细胞凋亡[13]。2011年Gong K等[26]用紫草素处理后的肝癌细胞中，检测到大量ROS，同时细胞内清除ROS的化合物也被明显抑制。2013年Ahn J等[27]发现紫草素处理后的癌细胞内ROS含量明显上升，诱导细胞凋亡。
3.1.2 促进细胞色素c释放，诱导细胞凋亡 Bcl-2家族是线粒体的外膜蛋白，在人的Bcl-2家族中，有些能抑制细胞凋亡，如Bcl-2和Bcl-XL，但是Bcl-2既属于线粒体途径又属于死亡受体途径，至今仍没有明确的归属。
Wu Z等[28]研究发现紫草素对Bax、Bcl、Cyt c、p53的基因表达都有影响。通过免疫及印迹发现，紫草素处理A373-S2细胞后p53的表达随之上调，并且Bax蛋白表达上调，而Bcl蛋白表达下调。之后，Cyt c大量释放，诱导细胞凋亡。这说明，紫草素作用于Bcl-2家族诱导的细胞凋亡的机制之一是激活p53的表达，激活Bax导致Cyt c的释放和Caspase的激活，引发细胞凋亡。2012年Chen C H等[29]利用半定量反转录PCR技术测定Bcl-2的表达，紫草素处理HL60细胞后Bcl-2的表达明显下调。2013年Liu C[30]等使用定量PCR技术，发现紫草素能显著增加乳腺癌细胞内Bax和Caspase-3的表达，同时降低Bcl-2的表达。
孤儿受体TR3/nur77可以被多种生长因子或凋亡信号诱导表达，能参与细胞的增殖、分化发育和凋亡过程[31]。Liu J[32]发现乙酰紫草素能提高细胞内的Nur77蛋白的含量，促进Bcl-2定位于线粒体，诱导细胞凋亡。这些充分表明紫草素诱导的细胞凋亡和Bcl-2有密切的联系。
3.1.3 作用于CDK4诱导细胞凋亡 Chen C H等[29]还发现紫草素能上调U87MG细胞内p53的表达，并且紫草素诱导癌细胞产生ROS与p53的表达上调有关。Yang Q等[33]也发现紫草素诱导的细胞凋亡与ROS介导的DNA破坏和p53的表达上调有关系。紫草素能使p53表达增加之后有略微下调，紫草素对p53基因还有活化作用。p53作为重要的抗癌基因对G1和G2/M期有校正功能，p53的下游基因P21的编码产物是一个依赖Cyclin的蛋白激酶，能与周期蛋白Cyclin结合，引起相应的蛋白激酶活性被抑制，阻断细胞周期。在基因表达异常的情况下，突变型p53的活化，并不仅仅引起细胞对受损DNA的修复，还可以引起细胞凋亡。
3.2 经死亡受体介导的细胞凋亡途径
Masuda Y等[34]发现紫草素能抑制肿瘤坏死因子相关受体蛋白TRAP1的基因的表达。他们用β-羟基异戊酰紫草素（β-HIVS）处理白血病细胞HL60、肺癌细胞DMS114后发现：在凋亡过程中，线粒体的中TRAP1蛋白的量逐渐减少。用TRAP1特异的siRNA处理肺癌细胞DMS114会对β-HIVS诱导的细胞凋亡更加敏感，并且促进线粒体中的Cyt c释放。结果表明紫草素能降低TRAP1的表达，在诱导细胞凋亡过程中起到十分重要的作用。阮敏等[35]研究发现，紫草素作用于舌鳞细胞（Tca-8113）后，磷酸酶-IKKPAba蛋白表达下调，同时细胞核内的NF-κB与DNA的结合性也下降。这表明，紫草素抑制NF-κB的活性，在诱导细胞凋亡过程中扮演重要的角色。Piao J L[36]用紫草素处理后发现细胞内ATF3和DDIT3大量表达，而肿瘤坏死因子（TNF）则是增加的主体。ROS还可以通过肿瘤坏死因子受体超家族的信号转导因子Fas及NF-κB来诱导细胞的的凋亡，从而实现由死亡受体介导的细胞凋亡途径。这些都说明紫草素诱导的细胞凋亡和死亡受体途径也有密切的联系。
3.3 经内质网途径介导的细胞凋亡途径
内质网途径是细胞凋亡的3大途径之一，与蛋白质的应激反应、Ca2+、CHOP、丝裂原活化蛋白激酶（MAPKs）家族都有密切联系。紫草素能非竞争性抑制p-ERK的活性，活化c-JNK诱导细胞凋亡。
3.3.1 作用于c-JNK、p-ERK诱导的细胞凋亡 Gong K等[37]发现，利用紫草素处理肝癌细胞后，细胞内的c-JNK含量明显提高。Singh F等[38]发现紫草素能非竞争性抑制pERK的活性，并活化c-JNK，通过调节p-ERK、JNK、PKC的活性，抑制肿瘤生长。利用人的表皮细胞，发现紫草素能抑制该细胞的增殖，通过降低EGFR、ERK1/2和酪氨酸的磷酸化水平，从而影响MAPK信号通路，使c-JNK的磷酸化水平增加。Mao X等[39]用紫草素处理慢性髓细胞性白血病细胞时，发现大量的细胞凋亡伴随ROS的大量产生、c-JNK的活化和Cyt c的释放。当抑制c-JNK的活化，或者消除活化的JNK后，Cyt c的释放和细胞凋亡率都受到明显的抑制。
p-ERK是内质网膜上的Ⅰ型跨膜蛋白，激活p-ERK之后，能够减缓蛋白质的合成作用，降低内质网应激反应的程度。但随着p-ERK活化时间的增长p-ERK也可能会诱导CHOP蛋白的活化，加剧细胞内质网应激反应，并最终诱导细胞凋亡。紫草素能够调节细胞内p-ERK的活化水平，从而在特定的情况下诱导细胞凋亡。紫草素能诱导c-JNK的活化，而活化后的c-JNK一方面能抑制Bcl-2抑制其抗凋亡活性，另一方面增AP-1的活性进一步促进p53、Bax、Fasl等促凋亡蛋白的表达，促进细胞凋亡。
3.3.2 诱导Caspase-7、Caspase-12活化诱导细胞凋亡 Kretschmer N等[40]发现，紫草处理黑色素瘤细胞后，细胞内Caspase-7的活性增强。活化后的Caspase-7能转移到内质网表面，与Caspase-12形成复合物，并最终活化释放Caspase-12，诱导细胞凋亡。
3.4 其他凋亡途径
3.4.1 降低PI3K/AKt磷酸化水平促进细胞凋亡 PI3K/ AKt信号途径与细胞的增殖、分化、凋亡、肿瘤的发生关系非常密切。该通路可以调节肿瘤细胞的增殖、分化，若这条信号途径发生异常反应，将会影响肿瘤细胞的扩散，血小管的形成，甚至还会影响肿瘤组织细胞外基质的降解[27]。
Wiench B等[41]利用miRNA和mRNA点阵技术分析，发现紫草素能通过降低Akt的磷酸化水平，影响PI3K-Akt-mTOR通路。PI3K-Akt-mTOR通路失控会造成肿瘤的发生。陈菊英等[42]利用紫草素处理MCF-7细胞，通过Western blot发现，该细胞的LC3-Ⅱ/ LC3-Ⅰ随之增加，p62蛋白的表达减少，总的PI3K、Akt的量减少，并且它们的磷酸化水平也会降低。这表明紫草素降低人乳腺癌细胞MCF-7细胞的活力与PI3K/Akt信号途径相关。
3.4.2 破坏DNA结构促进细胞凋亡 紫草素能诱导超螺旋质粒pBR322 DNA的断裂。Cheng H M[43]等发现紫草素有特定螯合功能，能诱导产生ROS，进而作用于Cu2+，诱导ROS和亲氧化剂的产生，最终诱导Hela 细胞凋亡。其次紫草素还能作用于DNA TOPI和TOPⅡ。紫草素能抑制TOPI的活性，降低DNA的稳定性，增加DNA结构被破坏的可能性。紫草素还能参与DNA断裂复合物的形成，TOPⅡ介导DNA断裂。Masuda Y[44]运用cDNA点阵技术分析发现，紫草素能明显抑制丝/苏氨酸蛋白激酶-1（PLK-1）的活性，用紫草素处理后，U937和HL60细胞内PLK-1的含量和活性都明显降低，从而降低DNA的稳定性，最终诱导细胞凋亡。
4 展望
尽管紫草素能诱导多种癌细胞凋亡，但距成熟的抗肿瘤药物尚有一定的距离。就目前看来，还存在以下一些问题：①紫草素抗癌机理的研究都大多集中在细胞水平或单一的细胞系水平，针对某一组织或者器官的疗效还有待考证；②目前紫草素诱导的细胞凋亡即使在体内也仅用于肿瘤异种移植，与真正的体内研究还有一段距离；③癌症的治疗往往需要药物联用，因此紫草素与其他药物或其他治疗手段的协同合作能力也有待进一步研究；④目前紫草素对正常细胞的不良反应研究比较缺乏，因此如何降低药物不良反应，也是重点之一；⑤目前部分研究用一定量的紫草素作用于癌细胞一定时间后，再用其他抗癌药物诱导癌细胞的凋亡，从而研究紫草素的耐药能力，但是紫草素处理的量和作用时间以及不同的组织和个体对紫草素的耐药有不同程度的影响，这些影响无疑阻碍紫草素成为成熟的抗癌药物；⑥目前紫草素不止一种，左旋紫草素和其他紫草素在应用上也有很大差异，因此要针对不同情况使用不同药物；⑦紫草素缺乏针对癌细胞的特异选择性，会导致正常细胞毒害作用，因此可以尝试对紫草素进行分子纳米材料修饰，或用一层特异的脂质膜包裹，或添加磁性材料与紫草素结合，外加磁场的作用下，加强紫草对癌细胞的特异性选择能力。以上问题阻碍了紫草素在临床实践中的运用，因此可以针对这些问题进行进一步的研究，以期尽早将紫草素广泛运用于抗肿瘤临床治疗。
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（收稿日期：2015-12-25）
（修回日期：2016-01-18；编辑：向宇雁）