基于CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术研究进展
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【摘 要】crispr/cas9 是最近发现的一种新型的基因组定点编辑技术。该系统为细菌与古细菌中抵御外源病毒和质粒DNA入侵的获得性免疫机制系统，与TALEN和ZFN 技术设计相比更加简单、更容易操作，目前，该技术已成功应用于人类细胞、细菌、斑马鱼、猪、小鼠、食蟹猴以及多种植物的基因组精确修饰，是最具有临床与应用前景的基因治疗技术之一。
早在1987 年，CRISPR序列由日本科学家在大肠杆菌中发现[1]，但由于这段序列的功能无法确定，因此该发现一直未引起人们的注意，随后，研究人员研究发现这种间隔重复序列广泛存在于细菌和古细菌的基因组中，随着人们对该结构的逐渐了解，2002 年，这种结构被正式定义为CRISPR。2005 年，研究人员发现CRISPR的间隔序列可以识别并结合特定的噬菌体DNA 序列，从而使得CRISPR序列在获得性免疫中发挥作用。2008 年，Marraffini 等[2]发现细菌CRISPR 系统能够阻止外源质粒的转移，并首次利用实验验证了CRISPR 系统的功能，科学家们也由此揭开了研究CRISPR 系统作用机制的序幕。
1 CRISPR的结构与分类
CRISPR 作为一种特殊DNA 重复序列，主要由多段长度为25 50 bp 长度的高度保守重复序列和26 72 bp 长度的间隔序列串联而成。同一个CRISPR位点中的重复序列一般具有极高的保守性，5’端与3’端部分尤为保守，但在微生物种间甚至同一个基因组的不同CRISPR位点间却存在较大的差异。另外，不同的CRISPR位点，其包含的间隔序列的数量差别也很大，从几个到几百个不等。
CRISPR/Cas 系统大体上可以分为3大类型：Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。其中，Ⅰ型和Ⅲ型在介导外源DNA 降解过程中需要多种Cas 蛋白来参与反应，形成的切割复合体结构复杂，Ⅱ型系统组分则较为简单，只需要一个Cas9 蛋白来切割DNA 双链。一个简易的Ⅱ型CRISPR/Cas 系统必定要含有gRNA 和Cas9，Cas9 蛋白具有改造crRNA 和破坏双链DNA 的双重功能，位于gRNA 5' 端的20 bp左右的碱基决定CRISPR/Cas9 系统在应用时Cas9核酸酶特异性切割的位点，主要负责决定CRISPR/Cas9 系统的特异性。目前以Ⅱ型CRISPR 系统为基础的CRISPR/Cas9 系统在基因组编辑中有较为广泛的应用。
2 CRISPR/Cas9的作用机理
CRISPR/Cas9 基因组编辑技术的基本原理为，将tracrRNA： crRNA 设计为引导RNA（gRNA），gRNA 包含位于5’端靶DNA 的互补序列以及位于3’端tracrRNA： crRNA 的似序列，利用靶DNA 的互补序列来定位需要编辑的位点，利用该类似序列与Cas9进行结合。该技术仅设计引导RNA 即可实现对含有PAM 序列的任一靶DNA序列进行插入、敲除与定点突变等修饰。由于设计操作简单、通用性好及编辑效率高等优势，CRISPR/Cas9 的基因编辑技术已成为TALEN 与ZFN之后的新一代基因组编辑技术。
另外，CRISPR/Cas9 系统还可以实现同时对多个不同靶DNA 序列进行编辑。利用CRISPR 位点自身的特点，设计对应不同靶DNA 序列的间隔序列，插入到重复序列之间，经过转录加工后会形成多个可定位于不同靶DNA 序列的双引导RNA，或者串联不同的sgRNA均可实现对哺乳动物细胞基因组的多个不同基因同时进行编辑。
3 CRISPR技术的应用
CRISPR/Cas9 系统作为新兴的基因编辑技术，目前已逐步在人类细胞、斑马鱼、小鼠、酵母、果蝇、细菌及水稻等作物中进行研究并报道。
在作物新品种培育和改造时，传统的转基因技术培育和改造新品种一般采用利用外源基因随机整合的方式，转基因表达的可控性较差。而CRISPR/Cas9 技术则可以进行定点修饰，达到高效定向。Shan 等用该技术敲掉了小麦的一个基因，得到了耐白粉病的小麦新品种。该团队还利用CRISPR/Cas9 技术定点突变了小麦和水稻两种作物的MLO 和PDS 等5 个基因。
在哺乳动物的研究方面，研究人员采用该技术建立基因打靶小鼠，结果证实，采用该技术不仅可以通过非同源末端连接途径实现对多个靶基因的定点敲除，还可以通过同源重组途径对多个靶基因进行靶向修饰。这些成果为其在生物工程、基础医学、医药学科等多种领域中的应用中提供了有力的基础。
4 展望
CRISPR/Cas9 作为细菌最为简单的Ⅱ型获得性免疫系统，被成功改造为继TALEN 与ZFN 之后新一代基因组编辑技术，为基因组的定向改造调控与应用等带来突破性革命，且相对于TALEN 和ZFN，CRISPR/Cas9有其独特的优势：（1）构建和设计方法简单快捷，成本低廉，适用于任何分子生物实验室；（2）用于基因组的点突变编辑效率优于ZFN和TALEN；（3）可同时实现多个基因的打靶。可见，CRISPR/Cas9 在基础理论研究、农牧渔业和临床治疗等领域必将有越来越广阔的应用前景。当然，目前关于CRISPR/Cas9 系统还有许多亟待解决的问题，相信随着人们逐步深入和全面的研究，CRISPR/Cas9 技术将会展现出其无比强大的生命力。
【参考文献】
[1]Ishino Y， Shinagawa H， Makino K， et al. Nucleotide sequence of the iap gene， responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli， and identification of the gene product [J]. J Bacteriol， 1987， 169（12）：5429-5433.
[2]Marraffini L A， Sontheimer E J. CRISPR interference limits horizontal gene transfer in staphylococci by targeting DNA. Science，2008，322（5909）：1843-1845.