大菱鲆造血器官肿大病的病原分离、鉴定及药物敏感性

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摘 要：从患造血器官肿大病大菱鲆（Scophthalmus maximus）肾脏中分离到菌株NY79，对该菌株形态特征、生理生化特性和16S rRNA等综合分析，鉴定NY79为迟缓爱德华氏菌。NY79菌株对健康大菱鲆进行人工感染的试验发现，感染发病症状与自然发病症状一致， 每条鱼的LD50为2.4×104 cfu，表明迟缓爱德华氏菌为大菱鲆造血器官肿大病的病原。药敏试验发现，NY79对阿莫西林等17种药物敏感，对红霉素等4种药物具耐受性。

关键词：大菱鲆；迟缓爱德华氏菌；人工感染；药物敏感性

中图分类号：S965.3 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2015.06.011

Abstract：The dominant bacterial strain， designated as NY79，was isolated from kidney which was diseased hematopoietic organs swelling of Scophthalmus maximus. The biochemical and physiological characteristics of the isolated strain was studied by conventional method， such as 16SrRNA. The result confirmed that the stain NY79 was Eduardsiella tarda. The challenge tests were carried out by Scophthalmus maximus. with the pure culture of the isolated stain. The symptoms of the artificially infected fish were similar to those infected naturally. The LD50 of per fish was 2.4×104 cfu， it confirmed that Eduardsiella tarda was the pathogeny of the hematopoietic organs swelling of Scophthalmus maximus. Antibiotic sensitivity test showed that NY79 strain were sensitive to amoxicillin and other 17 kinds of antibiotics， and were resistant to erythromycin and other 4 kinds of antibiotics.

Key words： Scophthalmus maximus； Eduardsiella tarda； artificial infection； antimicrobial susceptibility

大菱鲆（scophthalmus maximus）为鲽形目（Pleuronectifoanes）鲆科（Bothidae）菱鲆属（Scophthalmus）鱼类，原产大西洋东北部区域，因生长迅速，肉质鲜美，营养丰富，深受人们的喜爱。20世纪90年代被引进我国，如今已在我国北方沿海地区形成大规模工厂化养殖[1-2]。伴随着工厂化养殖的发展，大菱鲆的养殖规模不断扩大，养殖密度不断增加，但养殖过程病害频发，其主要原因是养殖水环境恶化以及药物尤其是抗生素的滥用。细菌性疾病是大菱鲆养殖过程中的主要病害之一。其中迟缓爱德华氏菌（Edwardsiella tarda）病最为常见，迟缓爱德华氏菌为兼性需氧革兰氏阴性杆菌，属于肠杆菌科（Enterobacteriaceae），爱德华氏菌属（Edwardsiella），该菌是一种重要的条件致病性人畜共患病原菌[3]。该菌的大规模爆发给水产养殖业带来巨大的经济损失，由此菌引起的鱼类传染病具有流行面积广、发病率和死亡率都特别高的特点。该菌引发多种疾病，如鱼类的败血症、腹水病等，它还能引起人类疾病，如脑膜炎、腹膜炎等[4]。

2013年秋季，笔者了解到天津滨海新区某养殖场的大菱鲆成鱼发生死亡，死亡率较高。从病鱼肾脏中分离出了一株优势菌，经人工感染证实了该菌是引起此次病害的病原菌。对该菌生物学性状和16SrRNA等进行研究，确定该菌为迟缓爱德华氏菌，并对该菌进行了药物敏感性试验，研究结果可为天津地区大菱鲆养殖细菌性疾病提供参考资料。

1 材料和方法

1.1 致病菌的分离

患病大菱鲆采自天津某养殖场，主要症状为鳍条充血，解剖可见脾脏、肾脏等造血器官肿大，疾病暂命名为大菱鲆造血器官肿大病。

选取症状典型的病鱼，通过无菌操作取病鱼的肝、脾、肾组织小块，分别划线接种于2216E、 TSA琼脂和SS培养基，28 ℃培养24～48 h。根据细菌形态学，观察选取优势菌株进行生化鉴定、分子生物学鉴定、回感试验和药敏试验。

1.2 分离菌株理生化鉴定

革兰氏染色：参照染色试剂盒说明书进行，主要步骤为涂片、干燥、固定、染色、镜检。

氧化酶试验：挑取菌落少许，均匀涂抹在氧化酶试纸上，30 s内观察结果，紫色为阳性，无色或者黄色为阴性。

氧化发酵试验：挑取单个菌落分别接种于2支氧化发酵生化管中，其中1支覆盖灭菌液体石蜡，放入（28±1） ℃培养18～24 h后观察结果。若生化管均变为黄色为发酵型细菌。1支未变色，1支变为黄色为氧化型细菌，2支均未变色为非发酵型细菌。

根据革兰氏染色、氧化酶和氧化发酵试验结果，采用ATB系统细菌鉴定系统对菌株进行生化鉴定，参照文献[5-6]判断分离菌株的种类。