革兰阴性杆菌产超广谱β?内酰胺酶的分布及基因型

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作者：孟灵 张润玲 尤崇革 王应芳

【摘要】

目的： 了解临床分离的革兰阴性杆菌中产ESBLs的流行特征及ESBLs基因型. 方法： 对我院临床分离的革兰阴性杆菌，采用改良三维试验检测产 ESBLs 菌株，用PCR对 ESBLs 基因进行分型. 结果： 175株革兰阴性杆菌分离出49株产ESBLs 菌，阳性率28%，包括大肠埃希菌、克雷伯菌属、阴沟肠杆菌、弗劳地枸椽酸杆菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌. 其中，第一位是阴沟肠杆菌（34.7%，17/49），其次是大肠埃希菌（30.6%，15/49）. 每种细菌产ESBLs率前三位是阴沟肠杆菌（56.6%，17/30），大肠埃希菌（37.5%，15/40），肺炎克雷伯菌（25.0%，6/24）. 各病区中神经科产ESBLs菌分离率最高(32.7%). 49株产ESBLs 菌携带TEM， SHV， CTX?M分别为34，5，16株，有17株同时携带两种β?内酰胺酶基因的菌株，占34.7%, 其中TEM+CTX?M型13株，占基因双阳性菌株的76.5%. 结论： 我院产ESBLs菌以阴沟肠杆菌、大肠埃希菌为主. 神经科是主要产ESBLs菌的病区. ESBLs基因以 TEM 型、CTX?M 型为主，携带双基因的菌株在我院有流行.

【关键词】 革兰阴性杆菌 β?内酰胺酶类 三维试验 基因型

0引言

超广谱β?内酰胺酶（ Extended?spectrum beta?lactamases， ESBLs）是质粒介导的由β?内酰胺酶(BLA)基因突变而形成的一类酶，是丝氨酸蛋白酶的衍生物. 它可水解头孢噻肟(CTX)，头孢他啶(CAZ)等三代头孢菌素和单环酰胺类抗生素，并可被β?内酰胺酶抑制剂（如克拉维酸）抑制［1］. 自1983年德国首次从臭鼻克雷伯杆菌中分离出SHV?2基因型ESBL以来，其数量及种类已在世界各地迅速增长. ESBLs基因型主要分为SHV,TEM,CTX?M,OXA型和其他型，目前已发现200多种( /studies/webt.htm). 不同的国家、地区、医院因其使用抗生素的种类和剂量不同,产ESBLs细菌的检出率、耐药性、基因型也有所差异. 为了解兰州大学第二医院革兰阴性杆菌产ESBLs的流行状况和基因分型，我们对49株革兰阴性杆菌进行了ESBLs的确认及其基因型测定.

1材料和方法

1.1材料头孢噻肟（CTX，30 μg/片），头孢硝噻吩纸片（Nitrocefin），M?H琼脂购自英国Oxiod公司；克拉维酸（山西威奇达药业有限公司）, 氯唑西林(山西博康药业有限公司 )；TaKaRa质粒DNA纯化盒，TaKaRa PCR 扩增盒， DNA Marker D3405A，引物购自宝生物（大连）有限公司. PCR分析仪（美国PERKIN ELMER），凝胶成像仪（德国Herolab），ABI DNA 测序仪（美国PE），电泳仪（北京六一仪器厂）. 大肠埃希菌ATCC 25922、肺炎克雷伯菌700603（卫生部临检中心）. 2005?05～09我院临床分离菌175株革兰阴性杆菌.

1.2方法

1.2.1改良三维试验对待测菌株利用冻融法获取粗酶提取液，滤菌器过滤后测定β?内酰胺酶呈阳性待用. 将CTX纸片贴于涂布了大肠埃希菌ATCC 25922的M?H平板中央，具其5 mm处用刀片向外分别切四个裂隙，在各裂隙中分别加入待测粗酶液（30 μL），粗酶液（30 μL）+克拉维酸液（2 mmol/L 10 μL），粗酶液（30 μL）+氯唑西林液（2 mmol/L 10 μL），粗酶液（30 μL）+克拉维酸液（2 mmol/L 10 μL）+氯唑西林液（2 mmol/L 10 μL），35℃过夜培养.

1.2.2ESBLs基因型酶（TEM, SHV, CTX?M?1型）PCR扩增 ① 引物设计： TEM型 T1(5′?ATA AAA TTC TTG AAG ACG AAA?3′),T2(5′?GAC AGT TAC CAA TGC TTA ATC A?3′)， 终产物1075 bp；SHV型S1(5′?GGG TTA TTC TTA TTT GTC GC?3′),S2( 5′?TTA GCG TTG CCA GTG CTC?3′)， 终产物928 bp；CTX?M?1型C1( 5′?GGC CCA TGG TTA AAA AAT CAC TGC?3′),C2(5′?CCG TTT CCG CTA TTA CAA ACC GTC G?3′) 终产物826 bp. ② 质粒提取：挑选待测菌单个菌落接种至2.5 mL含有氨苄西林(50 mg/L)的LB培养基35℃过夜培养，经23 000 g离心2 min，沉淀物采用碱裂解法提取质粒DNA. ③ 反应体系： 引物各0.25 μL， 10×PCR Buffer(+)(Mg2+PLus)5 μL，dNTP 4 μL，Taq酶0.25 μL，质粒模板2 μL，加去离子水至50 μL. ④ 反应参数：TEM型 变性94℃ 45 s，退火50℃ 45 s，延伸72℃ 1 min共30个循环；SHV型 变性94℃ 30 s，退火55℃ 30 s，延伸72℃ 1 min共30个循环；CTX?M型 变性94℃ 45 s，退火59℃ 45 s，延伸72℃ 1 min共30个循环.

1.2.3PCR产物测序PCR产物送宝生物（大连）有限公司，采用Sanger双脱氧链终止法测序，结果直接在GenBank中（www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST）进行序列比对分析.

1.2.4PCR产物聚丙烯酰胺凝胶电泳PCR产物点样于40 g/L聚丙烯酰胺凝胶，以8 V/cm的电压下进行电泳30 min后，经0.5 mg/L溴化乙锭染色，凝胶置于凝胶成像仪摄像.

2结果

2.1产ESBLs革兰阴性杆菌的菌株分布175株临床分离菌株检出49株ESBLs表型阳性菌，阳性率28%. 产ESBLs菌株中，最常见的是阴沟肠杆菌，其次是大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌，最少见的是弗劳地枸橼酸菌(表1). 各类革兰阴性杆菌产ESBLs率最高为阴沟肠杆菌，其次是大肠埃希菌、克雷伯菌属，铜绿假单胞菌产ESBLs率最低. 表1革兰阴性杆菌产ESBLs的分离率

2.2产ESBLs革兰阴性杆菌的科室分布产ESBLs菌在医院各科室广泛存在，神经科中比例最高，达32.7%(表2). 表249株产ESBLs菌的病区分布

2.3产ESBLs革兰阴性杆菌基因分型携带TEM型β?内酰胺酶基因的菌株为34株（69.3%），携带SHV型、CTX?M型基因的菌株分别为5株（10.2%）、16株（34.7%），其他型别11株（22.4%）. 其中，有17株同时携带两种β?内酰胺酶基因的菌株，占34.7%，TEM+CTX?M型13株（26.5%），TEM+SHV型3株（10.2%），SHV型+CTX?M1株（2.0%）. 各型PCR扩增产物电泳见图1，菌株详细ESBL基因分型.

3讨论

产ESBLs菌株主要引起医院感染和流行. 从对本院的研究表明，我院产ESBLs菌分布范围广，分离率高. 其中所占比例最高的是阴沟肠杆菌（34.7%），其次是大肠埃希菌（30.6%）. 近年来，我国各地区产ESBLs大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌分离率，一般在15%～35%左右［2］，2003年以来，部分城市已高达40%［3］. 本研究产ESBLs大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌的分离率分别是37.5%, 25%，与全国水平相当. 各地区对产ESBLs阴沟肠杆菌的分离率差异较大，佘丹阳等［4］在106株阴沟肠杆菌中发现单纯产ESBLs占10.4%（11/106），肖庆忠等［5］报告阴沟肠杆菌产ESBLs达55.2%（117/212），本院阴沟肠杆菌产ESBLs率高达56.6%，与广州地区相似，可能与本院菌株分布，用药种类不同或存在局部流行有关.

我院多个科室中均分离到ESBLs菌，表明全院面临产ESBLs菌感染的威胁，应引起高度重视. 其中，ESBLs菌在神经科最常见（32.7%）. 推测原因神经科入住的危重患者多，第三代头孢菌素使用量较大，在抗生素的选择性压力下，导致了ESBLs产生株增多.

PCR结果表明本院产ESBLs革兰阴性杆菌主要产TEM型β?内酰胺酶，以大肠埃希菌和阴沟肠杆菌为主，其次是CTX?M型，主要集中于阴沟肠杆菌. 本院SHV型β?内酰胺酶少见，主要由克雷伯菌属产生. 产TEM型、CTX?M型β?内酰胺酶在鲍曼不动杆菌检出，但不排除存在其他型别的可能. 李蓉等［6］检测15株鲍曼不动杆菌主要为 TEM 型、PER 型β? 内酰胺酶基因和 OXA?23 型碳青霉烯酶基因. 本研究中三株铜绿假单胞菌均不含blaTEM, blaSHV, blaCTX，说明可能为其他型别，有待进一步研究. 有报道，铜绿假单胞菌最常见为PER型［3］. 值得关注的是，本院产ESBLs菌TEM, SHV, CTX基因双阳性的比率达34.7%，表明产ESBLs菌携带两种β? 内酰胺酶耐药基因是我院的流行特点. 其中，阴沟肠杆菌TEM型和CTX?M型阳性占52.9%（17/9），多个耐药基因的存在造成阴沟肠杆菌的耐药谱扩大［7］. 北京张永利等［8］在12株阴沟肠杆菌中检出5株同时携带blaTEM, blaCTX，推测产 ESBLs 菌可通过质粒进行细菌间耐药基因的交换，同一菌株质粒上有2种或2种以上ESBLs编码基因.

本研究我们发现CTX?M型β?内酰胺酶在我院有流行,具有重要的意义. 国内报道产ESBLs的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌的基因型主要是CTX?M型［9］，与我国头孢噻肟用量多于其他三代头孢菌素有关. 我院头孢噻肟的用量也有此特点. CTX?M型ESBLs菌株可通过转座子从染色体转移至质粒，并通过质粒使耐药性广泛传播,从而存在爆发流行的潜在性. 因此，临床要避免滥用抗生素，重视细菌耐药的检测，控制耐药菌株的传播，减少医院感染的发生.

【参考文献】

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［4］ 佘丹阳，刘又宁.AmpC酶和超广谱?β内酰胺酶在阴沟肠杆菌中的表达及其耐药性的影响［J］.中华医学杂志,2002,2:211-214.

［5］ 肖庆忠,苏丹虹,江洁华，等. 广州地区3 500株革兰阴性杆菌TEM和SHV型超广谱β?内酰胺酶基因分型研究［J］.中华检验医学杂志,2005,28(10):1010-1014.

［6］ 李蓉,李文林,石小玉,等，产ESBLs鲍曼不动杆菌的耐药特性、质粒谱及耐药基因型［J］. 中国抗生素杂,2006,31(4)：202-205.

［7］ 孟灵，张润玲，王应芳. 我院2000～2004年医院感染革兰阴性杆菌耐药性趋势的研究［J］. 中国医学检验杂志，2006,7（3）：167-169.

［8］ 张永利,顾怡明,张杰，等. 多重耐药阴沟肠杆菌β?内酰胺酶编码基因的研究［J］.中华医院感染学杂志,2004,14(5):481-486.

［9］ 季淑娟,顾怡明,谭文涛.中国部分地区大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌超广谱β?内酰胺酶基因型研究［J］.中华检验医学杂志,2004,27(9):590-593.