成神经分化的骨髓间充质干细胞向C6细胞条件培养基和SDF?1α的趋化性迁移研究

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【摘要】 目的: 探讨成神经分化的骨髓间充质干细胞(bmscs)向c6细胞条件培养基和sdf?1α的趋化性迁移。方法: 采用碱性成纤维生长因子(bfgf)、 丁羟基茴香醚(bha)、 二甲基亚砜(dmso)联合诱导剂对bmscs进行诱导分化, 通过免疫荧光染色检测诱导的细胞表达神经前体细胞标志物nestin、 β?iii?tubulin和nse的情况。运用dunn chamber研究成神经分化的bmscs向胶质瘤和sdf?1α的迁移。结果: bmscs能诱导分化成神经元样细胞, 而对照组的bmscs形态无变化。dunn chamber分析显示, c6细胞条件培养基组和sdf?1α组诱导细胞的迁移速率和迁移效率明显高于对照组, 表明c6细胞条件培养基和sdf?1α对bmscs具有趋化作用, 单个细胞迁移轨迹实验也证实了这一结果。此外, 分化不同状态的bmscs向c6细胞条件培养基和sdf?1α的趋化程度也不同。结论: bmscs的定向迁移与分化状态密切相关。

【关键词】 骨髓间充质干细胞; 分化; 迁移; 趋化性

tropism of bone marrow mesenchymal stem cells in neurogenic differentiation for c6 conditioned medium and sdf?1α

bao pu?hua, wang min, su jun, liu meng?yu, zhang huan?xiang*

department of cell biology, medical college of soochow university; jiangsu province key laboratory of stem cell research, suzhou 215123, china

[abstract] aim: to investigate the tropism of bone marrow mesenchymal stem cells (bmscs) in neurogenic differentiation for glioma and sdf?1α. methods: bha, bfgf, and dmso were used to induce the neural differentiation of bmscs, and the expression of neural markers, nestin, β?iii?tubulin and nse were analyzed by immunocytochemistry. we investigated, by using the dunn chamber, the migration of bmscs in neurogenic differentiation towards glioma and sdf?1α. results: bmscs could be induced to differentiate into neuron?like cells, while the control remained the morphology of bmscs. dunn chamber analysis revealed that both the migration speed and efficiency of cells induced by c6 conditioned medium and sdf?1α were higher than control, demonstrating the chemotactic effect of both c6 conditioned medium and sdf?1α on bmscs. these results were confimed by examination of migration tracks of individual cells. moreover, bmscs at different states of differentiation showed different degree of tropism for c6 conditioned medium and sdf?1α. conclusion: the directed migration of bmscs is closely related to the differentiation states of these cells.

[keywords]bmscs; differentiation; migration; tropism

恶性胶质瘤是目前最为盛行的脑瘤, 干细胞移植极有希望治疗胶质瘤。因骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, bmscs)体内体外均显示很强的胶质瘤趋化性[1], 所以应用bmscs治疗胶质瘤即是很好的细胞治疗手段。然而处于不同分化状态的bmscs, 尤其是成神经分化过程中的bmscs能否改变其向胶质瘤趋化性迁移的能力, 还不得而知。众多研究表明, c6细胞分泌的多种细胞因子影响bmscs的定向迁移, 如sdf?1α。鉴于此, 本实验利用化学诱导剂联合细胞因子的诱导方法, 研究成神经分化的bmscs向c6细胞条件培养基和sdf?1α的趋化性迁移。

1 材料和方法

1.1 材料 倒置相差显微镜购自日本olympus公司、 co2培养箱购自德国heraeus公司、 恒温离心机购自法国jouan公司、 35 mm培养皿和细胞培养瓶购自美国coring costar公司。l?dmem培养基、 h?dmem培养基、 胎牛血清(fbs)均购自gibco公司, 小牛血清(fcs)购自hyclone公司, percoll淋巴细胞分离液购自pharmacia公司, 胰蛋白酶(trypsin)、 edta、 碱性成纤维生长因子(basic fibroblast growth factor, bfgf)、 丁羟基茴香醚 (butylated hydroxyanisole, bha)、 二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide, dmso)、 多聚赖氨酸(pll)、 fitc标记β?iii?tubulin抗体均购自sigma公司, n2 supplement购自paa公司, hochest 33258、 l?谷氨酰胺购自上海生工, fitc标记抗鼠cd29、 cd34、 cd45、 cd71、 cd90 (mab)、 pe标记抗鼠cd106 (mab)购自cedarlane公司, 抗鼠nestin、 nse、 gfap (mab)均购自chemicon公司, fitc标记抗鼠二抗购自upstate公司, sdf?1α购自peprptech inc公司。sd大鼠购自苏州大学实验动物中心。

1.2 方法

1.2.1 bmscs的分离培养与鉴定 自100～150 g sd大鼠的股骨、 胫骨中提取骨髓细胞, 置于密度为1.073 g/ml的percoll分离液, 3 000 r/min离心30 min。去上清, 吸取白膜层, pbs洗细胞, 1 800 r/min离心10 min。用含100 ml/l fbs的l?dmem培养液悬浮细胞, 计数, 将细胞密度调至2×109/l, 接种于t25培养瓶中, 置于co2培养箱中, 37℃、 50 ml/l co2饱和湿度条件下培养。每3 d换液。待细胞达90%汇合时用含2.5 g/l胰蛋白酶、 0.2 g/l edta的消化液按1∶2的比例进行消化传代, 用含100 ml/l cs的l?dmem培养液培养。

bmscs接种于35 mm培养皿中, 培养皿中预先放置包被有0.05 g/l多聚赖氨酸(pll)的盖玻片, 待细胞长至60%汇合, 进行免疫荧光染色鉴定其表面抗原cd29、 cd34、 cd45、 cd71、 cd90、 cd106的表达。染色步骤如下: 弃培液, 加入40 g/l多聚甲醛4℃过夜固定细胞。弃去多聚甲醛, 用pbs洗3次。加一滴(20 μl) mab滴在包好封口膜的载玻片上, 把固定了细胞的盖玻片覆盖在抗体上, 于湿盒内室温孵育90 min。pbs洗细胞, hochest 33258室温5 min, pbs洗细胞, 蒸馏水洗细胞, 500 ml/l的甘油(pbs配制)封片。免疫荧光染色的细胞用德国leica af6000荧光显微镜观察并采集图像。

1.2.2 bmscs的成神经诱导及鉴定 第8代bmscs以2×107/l的密度接种于预先包被盖玻片的35 mm培养皿中, 待细胞贴壁后采用以下诱导处理方法。(1)实验组: 换成含10 μg/l bfgf、 100 ml/l cs的l? dmem预诱导液培养, 24 h后换成含有200 μmol/l bha、 20 ml/l dmso的l?dmem诱导液诱导分化。5 h后换成含有10 ml/l n2的h?dmem维持培养基分别培养18 h和48 h。(2)对照组: 始终以bmscs常规培养基培养。定期观察细胞, 取诱导前及预诱导24 h、 诱导后5 h、 维持18 h和48 h的细胞固定, 进行免疫荧光细胞化学染色检测神经细胞标志物nestin、 β?iii?tubulin、 nse的表达情况。染色步骤参考前文细胞表型鉴定部分, 对于一抗非直接标记的, 需要加二抗, 即一抗孵育后, pbs洗细胞, 采用与一抗同样的方式滴加二抗, 室温孵育60 min, pbs洗细胞后用500 ml/l甘油封片, 荧光显微镜下观察摄影。

1.2.3 c6细胞条件培养基的收集 c6细胞在75 cm2培养瓶长到80%汇合度, 弃培养基, pbs洗细胞, 加入10 ml l?dmem, 24 h后收集这些培养液, 离心除去细胞碎片, 即为c6条件培养基, 置-20℃保存备用。

1.2.4 分化细胞的趋化性迁移 上述方法对bmscs成神经诱导, 取诱导前及预诱导24 h、 诱导后5 h、 维持18 h和48 h的细胞做dunn chamber迁移实验, 方法[2]如下: chamber内外槽加满l?dmem, 将长有细胞的盖玻片盖在槽的正上方, 细胞面朝下, 并使盖玻片一方紧盖住桥, 而不盖住外槽; 工业凡士林封住盖玻片三方, 吸水纸吸出外槽液体, 加入c6细胞条件培养基或sdf?1α, 凡士林封口; 对照组则不需吸出外槽的l?dmem, 直接用凡士林封住四面。用德国leica af6000荧光显微镜37℃活细胞拍摄8 h。

1.2.5 统计学分析 实验数据通过nih imagej软件处理, 细胞迁移通过德国leica af6000活细胞工作站进行拍摄。实验中所有的实验数据和统计量化图由systat.sigmaplot 和systat. sigmastat计算并绘制。数据分析p<0.05即认为有统计学意义。

2 结果

2.1 bmscs的表型鉴定 用免疫荧光染色的方法检测第8代bmscs常见的表面抗原。荧光显微镜下可观察到, 在蓝色激发光下, 经fitc标记的cd29、 cd71、 cd90染色的细胞表面呈绿色荧光; 绿色激发光下, pe标记的cd106染色呈现红色荧光, 均为阳性(图1)。造血干细胞特异性抗原cd34、 cd45则为阴性(结果未示), 以上结果与文献报道一致[3]。

2.2 bmscs成神经诱导过程中的形态观察 我们首先观察了bmscs成神经诱导过程中的形态学变化(图2)。接种24 h, 细胞成大多角型、 扁平星形(图2a)。预诱导24 h, bmscs由其典型形态变成长梭形, 胞体出现收缩, 细胞边缘变得不规整(图2b)。诱导5 h时, 胞体均呈圆形或椭圆形, 折光性增强, 伸出细长的突起, 并且多为两极突起(图2c), 小部分细胞出现死亡并脱落。换维持培养基至48 h时, 形态学改变的细胞数目增加, 细胞出现3个或更多分叉, 并出现次级分叉, 呈现出典型的神经元样(图2e)。

2.3 免疫细胞化学鉴定分化细胞 通过免疫荧光技术检测nestin, β?iii?tubulin, nse和gfap的表达情况来鉴定分化的细胞(图3)。如文献所报道, nestin存在于未分化的间充质干细胞中, 约有13.35%的bmscs表达nestin。在诱导5 h后, nestin阳性细胞百分比均显著上升, 阳性率达到80.05%, 同时超过85%的细胞表达β?iii?tubulin, 较未诱导的对照组具有显著差异, nse则呈阴性。随着维持时间的延长, nestin表达率下降, 维持48 h时, nestin阳性率只有27.78%。β?iii?tubulin的表达也在维持期有所下降, 维持48 h, 21.05%的细胞表达β?iii?tubulin。nse在诱导期和维持前期均为阴性, 到维持48 h时才有78.72%的细胞表达。整个诱导分化过程中, nestin的表达呈现出先增高后降低的趋势, β?iii?tubulin的表达在诱导初期显著升高, 晚期有所降低, nse在整个过程末期才开始表达。gfap在诱导前后均为阴性(图3)。免疫荧光染色的阳性细胞所占百分比统计结果见图4。

2.4 分化细胞向c6细胞条件培养基和sdf?1α的趋化性迁移 分化不同状态bmscs的迁移通过德国leica af6000活细胞工作站拍摄得到图像, 应用nih imagej分析图像得到细胞的迁移速率(图5)、 迁移效率(图6)和诱导5 h的迁移轨迹(图7)。我们可以看出外槽为c6细胞条件培养基时, bmscs预诱导24 h、 维持18 h和维持48 h, 迁移速率明显高于对照组(图5b, d, e), 这说明c6细胞条件培养基中含有趋化分化细胞迁移的因子; 与对照相比, sdf?1α则更加趋化bmscs和诱导5 h的分化细胞的迁移(图5a, c)。c6细胞条件培养基能提高预诱导24 h和维持48 h的分化细胞的迁移效率(图6 b, e); sdf?1α提高了bmscs、 维持18 h和维持48 h的分化细胞的迁移效率(图6a, d, e)。接着, 我们分析得到了诱导5 h的分化细胞的迁移轨迹, 纵轴的方向为趋化因子浓度梯度方向。c6细胞条件培养基和sdf?1α均能趋化诱导5 h的分化细胞的迁移, 而对照组细胞的迁移轨迹无规则(图7)。

3 讨论

与传统治疗方法相比, 利用细胞作为载体携带治疗药物杀死肿瘤及具有侵蚀性的散在瘤细胞是一项很好的治疗方法。由于多种干细胞(nscs, bmscs和造血干细胞)能向胶质瘤产生趋化性迁移, 所以这些细胞都成为很好的治疗载体[4, 5]。bmscs是骨髓中除造血干细胞以外的非造血性干细胞, 具有多种分化潜能。在不同的诱导条件下, 能够向软骨细胞、 肌细胞、 脂肪细胞以及神经细胞等不同的细胞系分化[6, 7]。bmscs还具有取材方便, 对机体损伤小, 体外培养增殖能力强等优点, 选用自体bmscs进行组织再生或移植, 不仅没有移植排异反应, 还避免了伦理纷争。因此, bmscs不失为治疗胶质瘤的细胞载体。

bmscs 向神经元样细胞的分化, 首先由woodbury等[7]首次报道, 他们在无血清的l?dmem 中加入二甲基亚砜(dmso)、 丁羟基茴香醚(bha) 等试剂可诱导bmscs分化为神经元样细胞。padovan等[8]报道人bmscs受到神经营养因子诱导后表达未成熟神经元标志(β?iii?tubulin)。carpenter等[9]报道了bfgf对培养的干细胞有明显的刺激增殖作用, 而且在低浓度下具有诱导干细胞向神经元样细胞分化的作用。bfgf在神经系统能维持神经元和神经胶质细胞的存活, 诱导神经元合成神经特异性基因(scg?10)产物和乙酞胆碱转移酶, 促进交感和副交感神经元的轴突生长, 并具有丝裂原样作用[10]。本实验中bmscs经bfgf诱导后, 细胞变成长梭形, 不同于正常状态的bmscs。免疫荧光检测预诱导的细胞, nestin和β?iii?tubulin的表达较对照明显增强, 此时nse的表达没有明显变化, 可能是bfgf发挥了作用, 使bmscs朝着神经样细胞分化。诱导5 h的细胞表达nestin和β?iii?tubulin达到最强, 而nse的表达仍没有显著变化。当换成维持培养基, 维持48 h, 此时nse的表达才显著增强, 而nestin和β?iii?tubulin表达明显减弱, gfap的表达一直是阴性, 说明bmscs可能是向神经元分化。

胶质瘤是如何趋化bmscs的机制还不清楚, 已知bmscs表达各种细胞因子受体, 如ccr1、 ccr4、 ccr7、 ccr9、 ccr10、 cxcr4、 cxcr5、 cxcr6、 cx3cr1和c?met, 它们负责组织损伤后bmscs的归巢[11]。bmscs在体内可通过血液向脑内的胶质瘤迁移, 利用遗传工程使细胞大量产生if?β、 il?2, 将这些细胞移植到动物体内, 能明显延长动物的存活期[4, 12]。胶质瘤条件培养基能趋化bmscs的迁移, vegf?a参与了此趋化进程[1]。另有报道胶质瘤分泌的其他促血管生成因子也参与了此进程, 如: il?8、 tgf?β1、 egf、 pdgf[13]。nakamizo等[4]的研究表明egf、 pdgf、 sdf?1α是调节bmscs向胶质瘤趋化的关键因子, 中枢神经系统一旦受损, 便释放sdf?1α, 介导表达cxcr4(sdf?1α的受体)的nscs从大脑实质迁移到受伤部位。有报道胶质瘤也表达大量的sdf?1α, sdf?1α表达的多少与胶质瘤的级别、 侵袭性和存活率有关[14]。

本实验着重研究了成神经分化的bmscs向c6细胞条件培养基和sdf?1α的趋化性迁移。当dunn chamber内外槽均加入l?dmem时, 分化不同状态的bmscs的迁移速率波动范围较小(18-28 μm/h); 而当外槽加入c6细胞条件培养基或sdf?1α时, 细胞的迁移速率变化范围则较大, 分别为20～40 μm/h和15～45 μm/h(图4), 说明bmscs的定向迁移与细胞的分化状态密切相关。因诱导5 h的细胞迁移效率无显著性差异, 故分析了此时的细胞迁移轨迹(图6), 我们发现诱导5 h的分化细胞对c6细胞条件培养基和sdf?1α表现了更强的趋向性。除了sdf?1α, c6细胞条件培养基中还有其他细胞因子影响分化细胞的迁移, 还有待进一步的研究。

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