丹曲林钠细菌内毒素测定方法学验证
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[摘要]目的通过检验、控制丹曲林钠原料药的内毒素水平以期控制注射用丹曲林钠的内毒素限值，因此需要建立丹曲林钠原料药的细菌内毒素验证方法。方法用DMF溶解丹曲林钠至0.12mg/mL，以灵敏度为0.06EU/mL的两个厂家的鲎试剂，按照内毒素检测方法进行了鲎试剂灵敏度复核实验、溶剂干扰试验、样品干扰试验等方法学验证实验。结果两个厂家鲎试剂的入c均为0.06EU/mL，在0.5～2入之内；采用上述方法进行验证，溶剂及样品均无干扰。结论丹曲林钠原料内毒素验证需要DMF溶解样品，按照最低稀释浓度要求配制的供试品对内毒素的检测也没有干扰，因此可以判定可用该方法对本品进行内毒素检查。
[关键词]丹曲林钠；细菌内毒素；方法学验证；DMF
[中图分类号]R927
[文献标识码]A
[文章编号]2095-0616（2017）03-53-04
丹曲林钠的商品名为Dantrium，是美国保洁（P&G）公司研制的药物，于1979年被美国FDA批准上市。丹曲林钠用于治疗恶性高热。恶性高热（malignant hyperthermia，MH）是一种严重的骨骼肌肉代谢亢进综合征，是一种常染色体显性遗传性疾病。MH的发生主要是基于骨骼肌细胞内迅速且不可控的ca2+浓度增加，进而产生致死性的代谢亢进危象，在没有特异性治疗药物的情况下，一般的临床降温措施难以控制体温的增高，最终可导致患者死亡。据报道，在接受全身麻醉的患者中MH发生率在1：10000到1：250000，且各地发生率各有差异。有丹麦研究称MH发病率在1：250000，纽约的一项研究称MH发病率在1：100000，同时，另一项法国的研究发现全身麻醉中MH发生率可达1：10000，而且他们发现利用基因检测的方法预估其发病率应该在1：2000到1：3000之间。近来，有研究称携带MH相关治病基因的几率可高达1：400。丹曲林钠是特异性RYRl受体拮抗剂，是目前公认的治疗MH发作的特效药，它能够关闭RYRl受体的异常开放，迅速减少肌质网释放Ca2+，从而终止MH发作。其具体作用位点尚不明确，有研究称可通过改变RYRl与DHPR间的联系从而抑制DHPR通道，或者通过与RPRl特异性位点结合而抑制该通道。丹曲林钠自1979年使用以来，MH的死亡率大大降低，从80%降低至不足10%。有研究称在MH发生早期（30min内）使用丹曲林钠，其死亡率有明显降低。
内毒素（endotoxin）是一种革兰阴性细菌细胞壁外膜的主要组成成分，其化学本质为脂多糖（1ipopolysaccharide，LPS），是诱发炎症反应过程中主要的致病成分。因此，对于注射剂必须严格控制产品中的内毒素。本文主要阐述如何控制丹曲林钠的内毒素方法，具体研究如下。
1.材料
1.1实验器材
DZKW-2型恒温水浴锅（上海路达实验仪器有限公司），XW-80型旋涡混合仪（上海精科实业有限公司），101-2-BS型烘箱（上海市实验仪器总厂）。
1.2样品
丹曲林钠原料，由丽珠医药集团研究所提供。
1.3细菌内毒素工作标准品及检查用水
细菌内毒素工作标准品：批号为150601-200968，效价150EU/支；购自中检所；细菌内毒素检查用水：批号为1608220，装量为5mL/支，购自湛江安度斯生物有限公司。
1.4鲎试剂
鲎试剂1：灵敏度为0.06EU/mL；批号为1601042，装量：0.1mI/支；购自湛江安度斯生物有限公司；鲎试剂2：灵敏度为0.06EU/mL；批号为160201，装量：0.1mI]支；购自厦门市鲎试剂实验厂有限公司。
2.方法与结果
2.1细菌内毒素限值的计算
本原料制成的成品为注射用丹曲林钠，为静脉推注注射剂，已知注射剂最大可接受的内毒素剂量K=5EU/kg/h，根据本品所制备成的注射用丹曲林钠制剂说明书提供的临床最大使用量，M=600mg/60kg/h（20mg×30瓶），细菌内毒素限值L为：L=K/M=（5EU/kg/h）/600mg/60kg/h=0.5EU/mg，即每1mg丹曲林钠中含内毒素不超过0.5EU。
2.2最小稀释浓度的确定
C=入/L=0.06/0.5=0.12mg/mL，因此拟定最小有效稀释浓度为0.12mg，mL。
2.3鲎试剂灵敏度复核
将细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解，在旋涡混合器上混合15min，然后分步稀释制备成每1mL含内毒素0.12，0.06，0.03，0.015EU的溶液，依法测定（中国药典2015年版四部通则1143），结果见表1～2。
计算结果表明，鲎试剂1与鲎试剂2的入c均为0.06EU/mL，在0.5～2入之内，因此鲎试剂标示灵敏度为0.06EU/mL。
2.4干扰实验
2.4.1供试液制备方法
取本品及参比样品10mg，依法测定（中国药典2015年版四部凡例），试验结果表明本品在N，N-二甲基甲酰胺中溶解，在甲醇中微溶，在冰乙酸中极微溶解，在乙醚、水和乙酸中几乎不溶。具体试验结果见表3。
为了保证原料在较小体积的溶液中溶解，本品供试品制剂选用DMF溶解，制备成10mg/mL的溶液。
2.4.2溶剂干扰实验验证取溶剂DMF，分别制备溶液A、B、C、D，依法测定（中国药典2015年版四部通则1143），结果见表4。
由以上数据可得知，溶液A和阴性对照溶液D的所有平行管都均为阴性，溶液C的结果Es为入，在0.5～2入之内，Et为入，在0.5～2Es之内，因此可认为溶剂DMF在该检测浓度下对鲎试剂无干扰作用。
2.4.3样品干扰试验验证使用内毒素检查用水和浓度为0.12mg/mL的未检出内毒素的供试品溶液及细菌内毒素工作标准品。按表5、6分别制备溶液A、B、C、D，依法测定（中药典2015年版四部通则1143），结果见表5～6。
由以上数据可得知，两种鲎剂干扰试验中溶液A和阴性对照溶液D的所有平行管都均为阴性，溶液C的结果Es为）L，在0.5～2入之内；鲎试剂1干扰试验溶液B的Et值为0.07，鲎试剂2干扰试验溶液B的Et值为0.06，Et均在0.5～2Es之内；因此可认为供试品在该检测浓度下对鲎试剂无干扰作用。
2.5试验结果
由以上试验可知，选用的两种鲎试剂的灵敏度复核符合规定，而且选用的溶剂对内毒素的检测没有干扰，按照最低稀释浓度要求配制的供试品对内毒素的检测也没有干扰，因此可以判定可用该方法对本品进行内毒素检查。
3.讨论
细菌内毒素试验是利用鲎试剂检测供试品中或其表面可能存在的细菌内毒素浓度的一种方法。细菌内毒素试验的方法有：凝胶法（gelation assay）、浊度法（turbidimetric assay）、显色底物法（chlomogendcassay）、免疫法（immunology assay）等。其中经典方法是凝胶法。目前，各国药典收载的细菌内毒素试验法均包含凝胶法。
在凝胶法实验中，需要保证样品能够完成溶解，才能准确测定产品中的内毒素限值，但是，由于丹曲林钠几乎不溶于水，所以在进行内毒素验证时无法用水来溶解样品进行内毒素的检测。经过对丹曲林钠溶解度的系统考察，确定采用DMF来溶解。当使用非水溶剂溶解时，需要考察溶剂是否对内毒素的监测产生干扰，本实验进行了溶剂干扰实验，实验结果证明DMF对产品检测没有干扰。
因该产品在使用过程中将根据患者的具体病症进行较大量的给药，本品按照制剂说明书的最大给药剂量进行计算内毒素的限值，所以本品的内毒素限度较低，故选用灵敏度较高的（0.06EU/mL）鲎试剂。