列当中1个新的苯乙醇苷类化合物
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[摘要]为进一步了解列当Orobanche coerulescens全草的化学成分。采用大孔树脂柱色谱、硅胶柱色谱和反相ODS柱色谱等色谱分离技术对列当O coerulescens全草中的化学成分进行了系统地分离和纯化，通过NMR和MS等波谱学方法确定了分离得到的化合物的化学结构。从列当全草的50%乙醇提取物中分离得到1个新的苯乙醇苷类化合物，鉴定为2（3甲氧基4羟基苯基）乙醇1O[（13）OαL鼠李糖基4， 6O二阿魏酰基]βD葡萄糖苷。化合物1为新的苯乙醇苷类化合物，命名为列当苷B。经抑菌活性筛选，列当苷B具有一定的抑菌活性，为列当的主要活性成分之一，为该药材进一步活性研究和质量标准研究奠定了基础。
[关键词]列当； 提取分离； 结构鉴定； 苯乙醇苷类化合物； 抑菌活性
[Abstract]The constituents of the whole plant of Orobanche coerulescens were isolated and purified by using various column chromatographic techniques including D101， silica gel and ODS The structures were identified by spectroscopic analyses including NMR and MS A new phenylethanol glycoside was isolated from the whole plant of O coerulescens， and was identified as 2（3methoxy4hydroxyphenyl）ethanol1O [（13）OαLrhamnopyranosyl4， 6Odiferuloyl]βDglucopyranoside， named as orobancheoside B Through the antibacterial activity test， orobancheoside B was proved to have certain antibacterial activity， and be one of the main active components of O coerulescens The research result will laid a foundation for the medicinal materials and quality control research Activity screening， broomrape orobancheoside B has certain antibacterial activity， as one of the main active components of O coerulescens， and to constantly improve the quality of the medicinal materials laid a foundation
[Key words]Orobanche coerulescens； extraction and isolation； structure identification； phenylethanoid glycosides； antibacterial activity
列Orobanche coerulescens Steph为列当科列当属二年生或多年生寄生草本植物，别名紫花列当、兔子拐棍、独根草，广泛分布于内蒙古自治区，东北、西北和华北等地也有分布[1]。列当全草可药用，性温、味甘，具有补肾助阳、强筋骨、润肠的功效，主治肾虚、阳痿遗精、腰腿冷痛、神经官能症、小儿腹泄、消肿、肠炎、痢疾等，蒙医用于治疗炭疽[2]，列当也是传统中药肉苁蓉的代用品 [1，3]，可用于缓解肉苁蓉植物资源匮乏，扩大药源，具有广阔的开发利用前景。国内外有关列当化学成分的研究报道认为，苯乙醇苷类化合物是其主要活性成分[48]。为了进一步阐明其药用物质基础，以便于更好的开发利用该药材，本研究对列当50%乙醇提取物中的化学成分进行了研究，分离得到1个新的苯乙醇苷类化合物，命名为列当苷B（orobancheoside B），化学结构见图1。
1材料
UV1780型紫外分光光度计（日本岛津公司）；Nicolet 6700 傅里叶红外变换红外光谱仪（Thermo Fisher 公司）；DRX500核磁共振仪（Bruker公司）；双压线性离子阱串联高分辨质谱orbitrap Velos Pro（Thermo Fisher 公司）；Waters 2996 HPLC色谱仪配置PDA二极管阵列检测器（Waters公司）；C18反相硅胶（40～60 μm，Merk公司）；D101大孔树脂（天津浩聚树脂科技有限公司）；柱色谱用硅胶（青岛海洋化工厂）；氯仿，甲醇均为AR级试剂（北京化工厂），水为自制蒸馏水。
列当药材于2009年9月采集于内蒙古锡林郭勒盟西乌珠穆沁旗，由南京中医药大学王春根教授鉴定为列当科列当属植物列当O coerulescens，凭证标本保存于南京中医药大学药学院。
2实验部分
21提取与分离列当干燥全草10 kg，粉碎后用50%乙醇50 L加热回流提取3次，每次15 h，合并提取液，浓缩至约10 L。采用D101大孔树脂柱分离，依次分别用水、30%乙醇、60%乙醇进行梯度洗脱，收集60%乙醇洗脱部分，回收溶剂，得浸膏40 g，将这40 g浸膏加100 g硅胶（100～200目）拌样，另取硅胶1 000 g（100～200目），氯仿湿法装柱，干法上样，依次以氯仿甲醇50∶1，20∶1，10∶1，5∶1梯度洗脱，分别收集各洗脱馏分，回收溶剂。
取40～60 μm C18反相硅胶200 g，以40%甲醇湿法装柱（40 mm × 600 mm），将前述氯仿：甲醇（10∶1）洗脱部分以少量60%甲醇溶解，湿法上样，60%甲醇洗脱，以TLC检测，得化合物1（20 mg），见图1。
22水解反应与糖的鉴定化合物1的水解及衍生化反应：取化合物1（15 mg），加入2 mol・L-1 HCl（4 mL），于90 ℃水浴中反应2 h。加入等体积水饱和的醋酸乙酯萃取，移除醋酸乙酯层，将水层蒸干，加入左旋半胱氨酸甲酯盐酸盐（25 mg）于无水吡啶取1 mL溶解，置于60 ℃水浴下反应 1 h。再加入邻甲苯基异硫代异氰酸酯（5 μL），继续在60 ℃下反应1 h。反应完成后，直接作为供试品，进行 HPLC 分析。单糖对照品D葡萄糖和L鼠李糖各15 mg，采用相同的方法进行衍生化反应，反应后直接作为HPLC供试品。HPLC 分析条件：色谱柱为Cosmosil C18MSI（46 mm ×250 mm，5 μm）。流动相为25%乙腈（含 001%甲酸）；体积流量08 mL・min-1；柱温35 ℃；检测波长 250 nm。
23抑菌实验标准的金黄色葡萄球菌（ATCC 25923）用MuellerHinton肉汤在37 ℃下培养24 h，然后用09% NaCl溶液稀释至约05 McFarland标准浓度。化合物1用DMSO溶解，然后用二倍稀释法得到一系列浓度。1 mL溶液与9 mL MuellerHinton琼脂混合，最终化合物1在琼脂中的质量浓度256～1 mg・L-1。每点2 μL大约为15 × 104 CFU・mL-1的菌种被接种于琼脂上，然后37 ℃下培养24 h。以肉眼观察到的最低抑制细菌生长的浓度为该化合物的最小抑制浓度（MIC）。每个浓度平行3次。2% DMSO作为空白的阴性对照。以抗生素甲氧西林为阳性对照。
3结构鉴定
化合物1白色无定形粉末，Molish反应呈紫红色，说明该化合物为糖苷类化合物。红外光谱中1 698 cm-1处吸收峰说明化合物结构中含共轭羰基结构，而1 633 cm-1处吸收峰显示化合物结构中含苯环结构；UV （MeOH） λmax（log ε）： 326 nm （33）；HRESIMS m/z 851272 8 [M+Na]+，提示化合物的相对分子质量为828，分子式为C41H48O18 （计算值：851273 8 [M+Na]+），不饱和度为18。
化合物1的1HNMR，数据见表1，谱中含有3组典型的苯环ABX取代：分别是：δH661 （1H，dd，J=80，20 Hz），669 （1H，d，J=20 Hz），664 （1H，d，J=80 Hz）；δH 676 （1H，d，J=80 Hz），702 （1H，dd， J=80，20 Hz），706（1H，d，J=20 Hz）以及δH 672 （1H，d，J=80 Hz），692 （1H，dd， J=80，20 Hz），714（1H，d，J=20 Hz）。2组低场区氢信号δH 626 （1H，d，J=160 Hz），758 （1H，d，J=160 Hz）以及δH 634 （1H，d，J=160 Hz），765 （1H，d，J=160 Hz）说明结构中存在2个反式双键。
根据化合物1的13CNMR谱数据见表1及DEPT谱中δC 1692，1687信号可判断2个酯羰基的存在；根据1HNMR中δH 111 （3H，d，J=60 Hz），521 （1H，br s）和13CNMR中δC 189，1035推y存在αL鼠李糖结构，而1HNMR中δH 441 （1H，d，J=80 Hz）是典型的βD葡萄糖端基氢信号，结合13CNMR中δC 1049，649信号可推测βD葡萄糖的存在；将化合物1水解后衍生化进行HPLC分析，并与对照品对照，进一步验证化合物1中含有D葡萄糖（tR=2054 min）和L鼠李糖（tR=3247 min）。化合物1与已知化合物列当苷A[9]的结构极其类似，主要区别在于化合物1比列当苷A多1个阿魏酰基，而缺少鼠李糖4位的乙酰基取代。化合物1的HMBC相关可以进一步证实以上推断。
HMBC谱中，化合物1中葡萄糖端基氢δH 441 （1H，d，J=80 Hz）与C8（δC 726）远程相关，提示葡萄糖与苯乙醇连接成苷。鼠李糖端基氢δH 521 （1H，br s）与葡萄糖3′位碳信号δC 818远程相关，说明鼠李糖与葡萄糖3′位相连接。葡萄糖4′位氢信号δH 503 （1H，m） 与羰基碳信号C9″（δC 1687）远程相关，说明一个阿魏酰基与葡萄糖4′位相连；葡萄糖6′位氢信号δH 436 （1H，m），446 （1H，m） 与化合物1的另一个羰基碳信号C9″（δC 1692）远程相关，说明另一个阿魏酰基与葡萄糖6′位相连。另1HNMR谱中的δH 376 （3H，s），381 （3H，s），378 （3H，s）信号与13CNMR谱中的δC 570，569，569信号都说明化合物1含有3个OCH3信号，根据NOESY谱，见图2，δH 376 （3H，s）与δH 669 （1H，d，J=20 Hz），δH 381 （3H，s）与δH 706 （1H，d，J=20 Hz），δH 378 （3H，s）与δH 714 （1H，d，J=20 Hz）的相关信号以及苯环的取代类型，可以确定3个OCH3分别与3个苯环的3位相连。
综上所述，化合物1鉴定为2（3甲氧基4羟基苯基）乙醇1O[（13） OαL鼠李糖基4，6 O二阿魏酰基]βD葡萄糖苷，见图1。化合物1的1HNMR，和13CNMR数据归属见表1。该化合物为一新化合物，将其命名为列当苷B（orobancheoside B）。将化合物1进行抑菌实验测试，测得其MIC 为128 mg・L-1（阳性对照甲氧西林MIC为2 mg・L-1），说明其具有一定的抑菌活性。
4讨论
列当传统功效有治疗肠炎、痢疾、胃痛、腹痛、风湿关节痛等各类疼痛，现代药理研究证明苯乙醇苷类成分具有很好的抗菌、抗炎、抗氧化、增强记忆力等作用[1011]。本研究分离鉴定出的化合物1为苯乙醇苷类化合物，并通过抑菌实验证明了其具有一定的抗菌作用，进一步说明其活性成分与传统疗效一致。此外，列当抗氧化作用使其在防癌、抗衰老方面具有较高的临床应用价值[12]，这为进一步开发利用列当提供了广阔前景。鉴于其广泛而独特的生物活性，列当的活性成分与药理药效价值值得进一步的研究与开发。
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