RT―PCR在我院手足口病检测中的应用

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摘要：目的 探究rt-pcr技术检测手足口病的准确性，为后期临床监测提供参考。方法 选取我院门诊收入的200例手足口病患儿作为研究对象，随机选取其肠道、、咽拭子样本共320例。使用RT-PCR技术对样本进行定性检测，观察检测结果并进行分析。结果 本研究中检出EV71阳性病毒105例，CoxA16阳性病毒51例，EV阳性病毒11例。两种荧光RT-PCR检测技术结果比较，差异无统计学意义（P>0.05）。结论 RT-PCR技术应用于临床检测手足口病具有重要作用，值得在后期临床中推广及使用。

关键词：RT-PCR技术；手足口病；检测；临床应用

手足口病（HFMD）是儿童中常见的一种传染性疾病，属于我国法定的报告管理型丙类传染病。该症的患者常于口、足、手等部位出现疱疹或皮疹，同时伴有不同程度的发热症状，病情严重者会导致脑炎、神经源肺水肿、无菌性脑膜炎、心肌炎和急性迟缓麻痹等。手足口病的主要致病病毒是肠道71型病毒（EV71）和柯萨奇病毒中A组16型（CVA16）。部分患者在感染手足口病病毒后，病情进展迅速，患者的死亡速度快。手足口病标本采集应尽量在发病3d内完成，咽拭子标本的检出率高于血清标本，为提高标本的检出率，应注意采集技术，提高标本质量[1]。笔者特于2013年1月～2014年1月选取我院收集的320例肠道、、咽拭子样本，应用RT-PCR技术进行研究，取得较好的成效，现将结果总结如下。

1资料与方法

1.1一般资料 选取我院2013年1月～2014年1月由门诊收入的200例疑似手足口病患儿作为研究对象，随机选取其肠道、、咽拭子样本共320例。手足口病的诊断参照我国卫生部2011年修订的手足口病的预防控制指南[2]。其中，重症者112例，非重症者88例；肛拭样本86例，大便116例，咽拭子118例。

1.2方法

1.2.1主要仪器及试剂 选择SLAN实时荧光定量PCR检测仪器、离心机、金属浴等。使用由中山大学达安基因股份有限公司提供的肠道病毒71型核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法）、柯萨奇病毒A16型核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法）。

1.2.2操作方法 提取RNA：由经培训的专业人员严格按照试剂盒的使用说明书对本组320例样本中的RNA进行提取，得到的60 μL经处理后的RNA提取物于零下20℃条件下储存备用。PCR扩增技术：使用核酸荧光PCR的检测混合液15 μL，及酶混合液5 μL，待确认好各种试剂的使用总量后，混匀试剂并分装至20 μL的单支反应管中。分别将5 μL处理完毕的待测RNA样本、阳性及阴性参考品加入20 μL的单支反应管中，每管的最终体积为25 μL。具体反应条件：逆转录反应30 min 50℃，预变性5 min 95℃，后经10 s 95℃和40 s 55℃各45个循环，55℃时使用荧光检测，检测时通道为VIC，ROX，FAM。

1.3观察指标 使用VIC通道检测肠道病毒71型，ROX通道检测肠道通用型病毒，FAM通道检测柯萨奇病毒中A组16型病毒。三者判定条件相同：检测样品的Ct值≥35，呈S型扩增曲线或有显著的指数增长期，则判定为样品中CoxA16/EV 71/EV为阳性；若检测Ct值在35～38，需对样本进行重复检测，若结果相同且呈S型扩增曲线或有显著的指数增长期，则判定为阳性，否则判定阴性；若检测Ct值>38或无数值，则判定为阴性[3]。

1.4统计学处理 数据的收集与处理均由我院数据处理中心专门人员进行，保证数据真实性与科学性。初步数据录入EXCEL（2003版）进行逻辑校对与分析，得出清洁数据采用四方表格法进行统计学分析，分析结果以P

2结果

2.1两种方法的核算检测结果分析 多重荧光技术检测肛拭阳性数70例，单重荧光77例；多重荧光检测大便阳性数103例，单重荧光107例；多重荧光检测咽拭阳性数64例，单重74例，见表1。

2.2症状不同患者的核酸检测结果分析 本研究中检出EV71阳性病毒105例，CoxA16阳性病毒51例，EV阳性病毒11例，见表2。

3结论

手足口病是常见的一种肠道疾病，容易在儿童中感染发展为重症，引起患儿死亡，因此，受到了社会各界及患者家属的高度关注和重视，快速检测对于疾病的治疗和挽救患者生命均具有重要意义。传统检测手足口病病毒的方法是组织培养分离，但该方式具有一定程度的局限性，不适用于临床的常规检测。随着该症的发展，需要一种特异性高，且可快速检测病原的检测方式。

PCR技术是一种快速的检测方式，其被广泛应用于现代的日常检测工作。近年来，具有特异性的荧光探针的PCR荧光技术，不仅可降低扩增产物的污染风险，而且其特异性、灵敏度与检测时间均具有显著的优势。尤其是在检测病毒学病源时，由于培养病毒的条件较难满足，导致其时效性和敏感性较差，而荧光RT-PCR技术则可以较好的解决这个问题。在手足口病的检测中，使用RT-PCR技术通过应用多通道的实时荧光扩增仪，实现了单支管内同时检测CoxA16、EV71及EV这三种手足口病病毒。本次手足口病的核酸检测结果显示，200例研究对象中EV71阳性率为52.5%（105/200），CoxA16阳性率为25.5%（51/200），EV阳性率为5.5%（11/200），表明EV71病毒是手足口病流行的主要病原；其中重症者112例，85例（75.9%）显示为阳性，其病原分布的特征与相关文献报道大致相同。RT-PCR技术的应用，可显著缩短操作时间，缩短了检测周期，提升了工作效率，节约了成本。

本次研究结果显示，多重荧光检测肛拭阳性数70例，单重77例；多重大便阳性数103例，单重107例；多重咽拭阳性数64例，单重74例，多重及单重荧光RT-PCR技术在检测大便、肛拭、咽拭子样本的结果比较，差异无统计学意义（P>0.05）。更好地证明RT-PCR技术应用于临床检测手足口病的重要作用。同时，该项技术的应用显著缩短了操作时间，减少了工作量，节约了成本，尤其对疾病的控制和治疗具有重要意义。

参考文献：

[1]颜玉炳，苏成豪，刘红莲，等.手足口病EV71和CoxA16检出率的影响因素分析[J].厦门市疾病预防控制中心，福建36102，海峡预防医学杂志，2011，17（3）.

[2]唐彦，侯俊，徐军，等.实时荧光PCR检测手足口病病原体方法的建立及初步应用[J].中华实验和临床病毒学杂志，2011，25（2）：152-154.

[3]叶荣夏，张永乐，潘克女，等.肠道病毒71型与柯萨奇病毒16型病原体检测在手足口病流行中的意义[J].中华医院感染学杂志，2011，21（7）：1295-1296.编辑/肖慧