桃叶橙资源筛选评价及分子鉴定

开篇：润墨网以专业的文秘视角，为您筛选了一篇桃叶橙资源筛选评价及分子鉴定范文，如需获取更多写作素材，在线客服老师一对一协助。欢迎您的阅读与分享！

摘要：以湖北省地方特色柑橘桃叶橙为研究对象，开展了资源调查、搜集及评价工作。从品质分析角度阐述了当前桃叶橙已经成为一个品种群体，果实大小、种子数量和可溶性固形物含量等性状变化较大，影响了桃叶橙的鲜食品质，不利于桃叶橙产业未来的发展。通过测定并从中优选了24份单株资源，并针对育种目标进行了资源分类，为桃叶橙选育工作奠定基础。AFLP分子鉴定从DNA水平充分证明了参试样品发生了遗传物质的变异，同时也初步探明了各单株与桃叶橙8号、18号和139号的遗传进化关系。

关键词：桃叶橙；资源；评价；鉴定

中图分类号：S666.4 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2012）21-4823-04

Diversity Assessment of Taoye Orange （Citrus sinensis （Linn.） Osbeck cv. Taoye Cheng） Germplasm Resources and Molecular Characterization Using AFLP Markers

HE Li-gang1，JIANG Ying-chun1，WU Li-ming1，XU Miao1，TONG Zhu1，WANG Zhi-jing1，SUN Zhong-hai1，

WU Shu-yong2，CUI Xu-dong3

（1. Institute of Fruit and Tea， Hubei Academy of Agricultural Sciences， Wuhan 430209，China；

2. Local Specialty Service Center in Zigui County， Yichang 443600，China；

3. Production and Marketing Professional Cooperatives for Taoyecheng Orange in Quyuan Town of Zigui County，Yichang 443604，Hubei，China）

Abstract： Taking taoye orange as the research object， evaluation analysis on fruit quality showed that the range of fruit size， seed number and content of total soluble solid altered widely in Taoye orange， reduced the fresh food quality and contributed negatively to the development of Taoye orange industry. In addition， 24 germplasm resources were selected as candidates and classified into five classes for future selection according to breeding objectives. The results of AFLP analysis revealed the relationship between individual and No. 8， No. 18， or No. 139， and suggested that a genetic variation had happened definitely in selected germplasm resources.

Key words： Taoye orange； germplasm； diversity assessment； AFLP

桃叶橙原产于湖北省秭归县屈原镇龙马溪村低山地，由于其春梢叶片呈披针形，狭长似桃叶，故命名为桃叶橙。自20世纪60年代开始，湖北省农业科学院果树茶叶研究所就已开展了桃叶橙的相关研究工作。典型桃叶橙果实果形端正，果面橙红光滑，脐部有印圈，果肉橙黄，皮薄子少，浓甜质脆，汁多化渣，富玫瑰香气，具有甜、香、脆的独特风味，鲜食品质极佳[1]。由于其品质的优越性，桃叶橙与脐橙、夏橙并誉为“峡橙三秀”，曾是中国柑橘三大地方良种之一。

20世纪80年代，桃叶橙是秭归县重点推广和发展的柑橘良种，在秭归县境内各柑橘产区广泛栽培。然而，20世纪90年代脐橙引种成功，导致桃叶橙种植面积逐渐萎缩；同时，由于三峡库区蓄水工程的顺利推进，原有桃叶橙优良单株和桃叶橙丰产园均被淹没。其次，原产地栽培品种混杂，管理措施相对落后，影响了桃叶橙原有优良品质的发挥，导致果实大小参差不齐，种子偏多，品质下降，严重阻碍了桃叶橙商品化的生产[2，3]。因此，桃叶橙在市场竞争中处于劣势，受市场影响原产地农户也出现抛弃桃叶橙改种脐橙的现象，一定程度上更加速了桃叶橙种植面积的下滑和桃叶橙产业的衰落。基于桃叶橙产业的发展现状，拟通过对搜集到的桃叶橙群体资源进行品质测定，并进行综合评价分析，以筛选出果大、少核或无核和高糖低酸的候选单株，辅以AFLP分子标记技术进行遗传变异鉴定，从基因水平进一步确定桃叶橙优变单株，从而充分发挥桃叶橙特色资源优势和文化优势，为桃叶橙提纯选优、新品种选育及桃叶橙产业的发展奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

2009年和2010年连续两年在秭归县屈原镇广泛开展桃叶橙资源调查，单株编号，并采集树体中上部不同方位果实15个以上，待测。针对2009年和2010年入选复选的优良单株，依据编号随机采集树体无病虫危害的幼嫩叶片，液氮速冻后

-80 ℃保存用于AFLP分子鉴定。

1.2 品质测定

称取15个以上果实，计算单果重；分别用直尺一次性量取15个以上果实纵径和横径，计算果形指数；描述果实色泽（橙红、橙黄、黄）和香气有无；一次性切取5个以上果实，描述风味（甜酸、适中、酸甜）；测定5个果实赤道面皮厚，计算单果皮厚，并统计种子数量；采用糖度数显折射仪DRB0-45 （购自上海测维光电技术有限公司）测定果实可溶性固形物含量；可滴定酸含量测定采用酚酞指示剂法，VC含量测定采用2，6-二氯靛酚滴定法[4]。

1.3 DNA的提取

桃叶橙叶片基因组DNA提取采用改良CTAB法[5]。最后用30～50 μL TE缓冲液溶解沉淀，并于0.8%琼脂糖凝胶电泳进行质量检测。

1.4 AFLP分析

AFLP分析中所采用的引物及接头序列见表1，其中E 和M 分别表示EcoRⅠ系列引物和MseⅠ系列引物，具体操作流程参考文献[6]。酶切连接反应体系为25 μL，DNA底物为200 ng，EcoRⅠ和MseⅠ各2 μL，接头1 μL，10 mmol/L ATP 2.5 μL，T4 DNA连接酶1 μL，瞬时离心混合后37 ℃温育5 h，8 ℃继续保温4 h，4 ℃过夜。预扩增采用25 μL反应体系，DNA模板2 μL，预扩增引物1 μL，dNTPs 0.5 μL，Taq聚合酶0.5 μL，瞬时离心数秒，扩增参数：94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸80 s，30个循环。预扩增产物采用TE稀释20倍，取2 μL作为选择性扩增模板，选择性扩增引物1 μL，dNTPs 0.5 μL，Taq聚合酶0.5 μL，加入ddH2O至25 μL，瞬时离心数秒混匀，第一轮扩增参数：94 ℃变性30 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸80 s，以后每轮循环温度递减0.7 ℃，12个循环；第二轮参数：94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸80 s，23个循环。扩增产物加入10 μL Loading Buffer 混匀，95 ℃变性，4%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。

1.5 数据处理

品质测定结果导入Excel软件中，计算单果重、果形指数、皮厚以及可滴定酸和VC含量，采用SAS 9.2软件对计算结果进行标准差和变异系数的统计分析。AFLP分析中获得的DNA谱带进行数字化统计，有带的位置计为1，无带的位置计为0，将统计结果输入Excel表格中，利用NTSYS pc 2.10e数据分析软件进行聚类分析。

2 结果与分析

2.1 桃叶橙资源评价

2009年和2010年分别测定29份和44份桃叶橙单株果实样品。室内测定结果发现，桃叶橙果实色泽橙红，普遍具有香气，风味酸甜为主，汁多化渣。表2和表3统计分析结果表明，桃叶橙果实单果重89.00～205.40 g，变异系数2009、2010年分别为14.56%、14.99%，性状表现参差不齐；种子数变化大，变化范围0.70～15.70粒，变异系数2009年、2010年分别为39.87%、53.47%，极不稳定，影响鲜食品质；可溶性固形物含量变化相对较小，最低11%，最高可达14%，变异系数2009、2010年分别为6.28%、4.67%；可滴定酸含量也有较大幅度变化，变异系数2010年达40.36%；此外，果皮厚度变异也比较严重。根据大果、少核或无核和高糖等选育目标，2009年7份、2010年17份入选复选（表3、表4），并初步确定WGH-01、DYL-63和WSF-40作为重点候选优株，进入优良性状遗传稳定性观察阶段。为储备桃叶橙特色育种资源，对入选优株进行资源分类，结果见表5。

2.2 AFLP聚类分析

对2009～2010年参选的桃叶橙资源中的23份单株进行AFLP分子鉴定发现，64对通用引物中引物对E-ACT/M-CAA、E-ACT/M-CTT、E-ACC/M-CAA、E-ACG/M-CAA、E-AGC/M-CAA和E-AGC/M-CAC能够将大部分样品区别开。其中，以桃叶橙杂交父本金水柑为外部对照，桃叶橙各单株（包括杂交亲本及子代）在相似系数为0.28～0.67水平上聚类（图1），3株桃叶橙候选优株中，WSF-40和DYL-63与18号较为临近，与8号相距较远，说明WSF-40和DYL-63可能为18号营养系后代；WGH-01为139号营养系后代，与18号、8号差别均比较明显，聚类分析充分证明了这一观点。

3 小结

以柑橘地方特色品种秭归桃叶橙作为研究对象，旨在为重振桃叶橙产业奠定理论基础。桃叶橙在原产地具有深厚的群众基础和文化底蕴，在市场经济飞速发展的今天，充分挖掘和利用资源优势，有利于桃叶橙产业的复苏和壮大。拥有自主知识产权的品种是市场竞争的核心，发展桃叶橙产业必须具有性状优良的桃叶橙品种（系），针对这一目标，开展了广泛的资源调查、搜集及评价工作，并且初步确定桃叶橙品种（系）候选优株，然而由于桃叶橙目前在原产地栽培环境复杂，多为小范围种植，资源搜集难度较大，群体的覆盖率难以保证；其次，大多数单株资源仅采用一年的试验数据，其遗传稳定性还有待连续的观察和研究。

AFLP分子鉴定分析中，虽然将大部分样品区别开，但是对于桃叶橙8号、18号和139号的进化关系仍不明确，根据记载，18号来源于8号，聚类分析图中可以说明这一点，然而139号为18号的营养系后代，聚类分析没有反映这一点，这可能与分子鉴定过程中筛选的引物数量有关，由于仅采用了6对引物，无法覆盖全部基因组，不能客观反映基因组序列中所有的差异位点，通过增加筛选引物组合数量可以缓解。

参考文献：

[1] 向长海.秭归开展桃叶橙优良单株选育[J].中国果业信息，2009，26（12）：44.

[2] 孙林红，王耀群，吴述勇，等.桃叶橙丰产优质栽培技术措施[J]. 柑桔与亚热带果树信息，2001，17（2）：22-23.

[3] 向长海，周志虎，戈 伟，等.一代名品“桃叶橙”的发展现状与振兴对策[J].现代园艺，2008（9）：49-51.

[4] 李锡香. 新鲜果蔬的品质及其分析法[M].北京：中国农业出版社，1994.

[5] 许 淼，蒋迎春，孙中海，等.鄂柑一号椪柑少核芽变的AFLP分析[J]. 湖北农业科学，2011，50（17）：3556-3559.

[6] 周延清. DNA分子标记技术在植物研究中的应用[M].北京：化学工业出版社，2005.

收稿日期：2012-03-16

基金项目：湖北省研究与开发项目（2011BBB049）；湖北省农业科技创新中心资助项目（2007-620-001-03）；湖北省农科院果茶所青年科学基金

项目（GCJJ201203）

作者简介：何利刚（1982-），男，湖北罗田人，助理研究员，博士，主要从事果树生物技术育种和抗寒分子机理研究，（电话）027-87988653

（电子信箱）.cn；通讯作者，蒋迎春，研究员，（电话）027-87989513（电子信箱）.cn。