日本血吸虫童虫早期诊断抗原模拟表位的初步筛选研究
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【摘要】目的：利用噬菌体随机12肽库技术筛选日本血吸虫感染早期诊断抗原。方法：用日本血吸虫感染后21 d兔血清从噬菌体12肽库中经3轮筛选，有效地富集与早期感染兔血清有亲和力的噬菌体克隆。随机挑取11个单克隆分别纯化、扩增，随后采用ELISA、DOT-ELISA等检测方法，挑选出与早期感染兔血清有高亲和力的噬菌体克隆。结果：挑选出3个与感染后21 d兔血清具有高亲和力的噬菌体单克隆。结论：用感染后21 d兔血清从噬菌体随机12肽库中能筛选到日本血吸虫童虫早期诊断抗原模拟表位。
【关键词】日本血吸虫；童虫；早期诊断抗原；模拟表位；筛选
Screening on the Minotopes of Early Diagnostic Antigens of Schistosomula of Schistosoma Japonicum/LIU Xiang， NING Yong， XUE Jin-ruo，et al.// Medical Innovation of China，2013，10（20）：001-002
【Abstract】Objective：To screen the simulating antigen epitopes related with early diagnositic antigens of S.j by 12-mers random peptide library. Method：After performing three rounds of panning by using the affinity selection with infected rabbit sera at 21th day， target specific phages were effectively enriched from a random 12-peptides phage library. 11 positive clones selected randomly from them were compared and their antigenic ability was identified by ELISA. By using ELISA， phage clones with high affinity to infected rabbit sera were obtained. Result：3 of the 11 monoclonal phages were obtained. Conclusion：The positive phage simulating epitopes of Schistosomula of Schistosoma japonicum can been obtained from a random 12-peptides phage library.
【Key words】Schistosoma japonicum；Schistosomula；Early diagnositic antigen；Minotopes；Screen
First-author’s address：School of Medical Laboratory，HuBei University of Chinese Medicine，Wuhan 430065，China
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2013.20.001
噬菌体展示技术是利用外源性肽能以融合蛋白的形式呈现在丝状噬菌体的外壳蛋白表面，将编码多肽的外源DN段与噬菌体表面蛋白的编码基因融合[1]。这样多肽或蛋白不但以融合蛋白的形式展示在噬菌体的表面，且可保持相对的空间结构和生物活性。用抗体、受体、核酸、以及某些碳水化合物即可以从随机肽库中筛选出与之结合的肽段，因此，只要有抗体，便可以从噬菌体展示肽库中筛选出与之相结合的特异性抗原表位。本研究拟通过用感染早期动物血清对随机12肽库的免疫筛选来获得日本血吸虫童虫早期诊断抗原的模拟表位，为日本血吸虫感染的早期诊断提供候选抗原表位。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1钉螺及实验动物阳性钉螺购自湖南省血吸虫病防治研究所。日本大耳白兔购自武汉大学实验动物中心。
1.1.2细菌及噬菌体文库大肠杆菌ER2537株及噬菌体随机12肽库（滴度为1.5×1013 pfu/ml）均由中南大学湘雅医学院易新元教授惠赠。
1.1.3试剂及仪器聚乙二醇（PEG-8000）、HRP标记的羊抗兔IgG、羊抗鼠IgG、96孔可拆分酶标板均购于武汉亚法生物技术拓展公司；HRP标记鼠抗M13单克隆抗体购自英国Amersham Pharmacia Biotech公司；TNT试剂（10 mmol/L Tris.Cl pH 8.0；150 mmol/L NaCl；0.05% Tween20）、1%TBST
（50 mmol/L Tris-HCI，pH 7.5；150 mmol/L NaCl；1% Tween20）、TBS（50 mmol/L Tris-HCI，pH 7.5；150 mmol/L NaCl）、洗脱液（0.2 mol/L Gly·HCI，pH 2.2）、PEG-NaCl（20%PEG-8000；2.5 mol/L NaCl）、0.5%PBST（pH 7.4，0.5% Tween20）均为自配。高速冷冻离心机为上海安亭科学仪器厂出品（TGL-16G-A型）；恒温振荡器为常州国华有限公司出品（CHA-5型）；Rayto酶标仪为RT-2100型。
1.2方法
1.2.1处理血清首先制备大肠杆菌裂解液（大肠杆菌抗原），将其与兔混合血清（感染21 d）和TNT按1：5：5的比例进行混合以充分吸收血清中的抗ER2537抗体[2]。
1.2.2免疫筛选血吸虫感染早期诊断抗原模拟表位每轮筛选包括以下过程：（1）处理好的兔血清稀释包板；（2）3%脱脂奶粉37 ℃封闭；（3）TBST洗6次；（4）加肽库（二轮后为前一轮洗脱扩增液）稀释液；（5）洗涤，加洗脱液；（6）收集洗脱液，转化培养扩增[2]。
三轮筛选的条件不同，每一轮免疫筛选的回收率：噬菌体回收率（%）=（洗脱的噬菌体/加入的噬菌体）×
100%[2]。
1.2.3每轮筛选富集所得噬菌体与感染21 d兔血清的亲和反应包括以下过程：（1）噬菌体包板（浓度：1×1014 pfu/ml）；（2）封闭过夜，洗涤；（3）加一抗（感染21 d兔血清）；（4）加二抗（羊抗兔IgG），显色；（5）记录490 nm吸光度
值（OD490nm）[2-3]。
1.2.4ELISA鉴定阳性多克隆噬菌体抗原性同上，噬菌体包板，封闭后，加入不同兔血清进行抗原抗体反应，记录不同兔血清发生反应最高稀释倍数[2-3]。
1.2.5单克隆噬斑的挑取及纯化[2]
1.2.6ELISA鉴定噬菌体单克隆抗原性方法同1.2.4，酶标仪测定OD490nm值，cut off 值≥2.1判为阳性，计算各组相对阳性率[2-3]。
2结果
2.1阳性噬菌体的筛选富集与亲和力鉴定三轮筛选结果见表1。从表中可看出精三轮筛选，回收率逐步提高，呈数量级递增，最终回收率提高了二百多倍，说明阳性噬菌体得到有效筛选和富集。从表1中还可看出各轮噬菌体对感染21d兔血清的亲和力也同回收率一样呈对应性增强，其OD490nm分别为0.10、0.28、0.32。