以对羟基苯甲酸甲酯为内标用HPLC-UV法测定人血浆中氟康唑的含量
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作者:孟玲，王永庆，李娜，贾楠，陈玲
【摘要】 目的 建立用内标法测定人血浆中氟康唑浓度的HPLC-UV方法。方法 以对羟基苯甲酸甲酯为内标，血浆用氨水碱化后，用乙酸乙酯提取，测定血浆中氟康唑的浓度。结果 血浆中杂质不干扰样品峰和内标峰，10.0、2.0、0.5μg/ml的回收率分别为98.1%，96.3%及91.1%；批内精密度均小于8%(高、中、低浓度分别为 1.51%，3.20%及7.08%)，批间精密度均小于10%(高、中、低浓度分别为1.52%，4.21%及8.25%)，最低检测限为0.1μg/ml，线性范围为0.2～10.00μg/ml；血浆中氟康唑冻融是稳定的；精密度也符合要求。结论 该方法稳定且精密度好，准确可靠，适用于氟康唑血浆浓度测定。
【关键词】 氟康唑；对羟基苯甲酸甲酯；高效液相色谱-紫外；内标
Determination the human plasma content of fluconazole using the methyl parahy-droxybenzoate as a internal standard by hplc-uv method
【Abstract】 Objective To establish the determination method of fluconazole in healthy volunteers plasma. Methods The plasma was alkalified by ammonium hydroxide， and fluconazole was extracted by acetic ether； and methyl parahydroxybenzoate was used as internal standard. Plasma concentrations of fluconazole and internal standard were determined by HPLC -UV. Results The chromatographic peak of fluconazole and internal standard was not interfered by foreign matter. Recovery rate of 10.0、2.0、0.5μg/ml was 98.1%，96.3% and 91.1%， respectively. Precision in or between batch was less than 8.0% and 10.0%， respectively. Lowest detectable limit was 0.1μg/ml and linear range was 0.2～10.00μg/ml. The freeze thawing of plasma was stable. Conclusion The method was reliable and stable， it was suitable for determination the concentration of fluconazole in plasma.
【Key words】 fluconazole； methyl parahydroxybenzoate； HPLC-UV； internal standard
氟康唑（fluconazole）是新型抗真菌药物，由于其穿透力强，分布容积大，血清消除半衰期长，故具有长效特点，可用于多种组织器官深部真菌感染的治疗，具有一定的临床价值。文献报道的检测方法有微生物法、GC法和高效液相法。高效液相法是常用的血浆氟康唑的检测方法，有外标法和内标法，常用内标有非那西丁［1］、美托洛尔［2］、氨苯蝶啶［3］和MHD［4］。本文采用HPLC-UV法，以对羟基苯甲酸甲酯为内标，测定氟康唑血药浓度。
1 实验材料
1.1 试验药品 氟康唑标准品： 中国药品生物制品检定所提供（批号100314-0101），用超纯水配制成相当于1.0mg/ml 贮备液。临用时稀释至相应的浓度。对羟基苯甲酸甲酯(内标)江苏省药品检验所提供，用甲醇配制成相当于12.5μg/ml 贮备液。
1.2 试剂 乙腈（色谱纯）， Fisher Company， Inc，USA； 其余试剂均为市售分析纯。
1.3 仪器 导津高效液相色谱仪（2010）；Milli-Q Gradient A10超纯水器（Millipore Inc， USA）。
2 血浆中氟康唑的HPLC法测定
2.1 色谱条件 流动相由0.01mol/L KH2PO4(磷酸调pH=6.4)和乙腈（70：30，v/v）组成，流速1.0 ml/min；色谱柱为Alltima C18 5.0μm 250mm×4.6mm I.D.；柱温箱温度 30℃；检测波长261 nm。
2.2 血浆样品的提取与分离 精密吸取血浆1.0ml置15 ml玻璃离心管中，加入10μl对羟基苯甲酸甲酯（12.5μg/ml，内标），涡漩混匀30s，加入200μl氨水，振荡混匀30s，加入5ml乙酸乙酯，振荡3min，3500rpm离心10min，取有机层挥干，残渣用100μl流动相溶解，15000rpm离心10min，取上清液20μl进样分析。
2.3 方法的专属性 在本试验条件下，氟康唑和对羟基苯甲酸甲酯有较大的色谱峰和较好的分离度，血浆中杂质不干扰样品峰和内标峰，基线噪音小，氟康唑和对羟基苯甲酸甲酯的保留时间分别约为4.5min 和7.5min(见图1)。
图1 氟康唑色谱图
A.空白人血浆； B.标准品； C. 人空白血浆+标准品； 1. 氟康唑 2. 对羟基苯甲酸甲酯
2.4 血浆中氟康唑标准工作曲线制备及其最低检测浓度测定 取空白血浆1.0ml，加不同量的标准品，使其浓度分别为0.2、0.5、1.0、2.0、5.0和10.0μg/ml，按“血浆样品的提取与分离”项下操作，记录样品和内标峰面积，计算样品/内标峰面积比值R样品/内标，利用样品浓度C对比值R样品/内标作直线回归，得回归方程：
R样品/内标= 0.1498C-0.0093，r=0.9999，(P<0.01， n=5)(见图2)，线性范围0.2～10.00μg/ml，最低检测浓度0.1μg/ml。
图2 血浆中氟康唑工作曲线
2.5 回收率测定 按标准曲线测定方法配制0.50，2.00，10.00μg/ml的3种不同浓度的血浆样本各5份。按“血浆样品的提取与分离”项下进行测定，记录样品和内标色谱峰面积，计算比值。另用水代替血浆同样方法配制相应浓度的氟康唑溶液进样测定，以此为标准，将两组峰面积比值进行比较计算氟康唑的回收率，高、中、低浓度的回收率分别为：98.1%，96.3%及91.1%。
2.6 方法的精密度试验 按标准曲线测定方法配制0.5，2.0，10.0μg/ml的3种不同浓度的血浆样本，按“血浆样品的提取与分离”项下操作，进行色谱分析测定。每个分析批3个浓度各配制5份，连续测定3个分析批，分别计算批内和批间精密度，高、中、低浓度的批内精密度分别为：1.51%，3.20%及7.08%；高、中、低浓度的批间精密度分别为：1.52%，4.21%及8.25%。
2.7 稳定性试验 按标准曲线测定方法配置0.50，2.00，10.00μg/ml的3种不同浓度的血浆样本各10ml。各浓度取1ml按“血浆样品的提取与分离”项下操作，处理后立即测定，另取1ml常温放置8h后按血浆样品处理方法处理后测定，剩余血浆冷冻贮藏，并分别于第3、6、10天取出血浆解冻，各取1ml按血浆样品处理方法处理后测定，计算平均值和精密度，高、中、低浓度的血样稳定性精密度分别为：2.51%，5.29%及8.19%。表明稳定性良好。
将第0天处理好的稳定性样品放置于冰箱冷藏室，分别于第2、4、6、8h测定该份样品，考察其样品放置的稳定性。高、中、低浓度的样品放置稳定性精密度分别为：2.02%，4.16%及7.34%。样品在8h内稳定。
2.8 准确度试验 按标准曲线测定方法配制0.5，2.0，10.0μg/ml的3种不同浓度的血浆样本，重复测定5次，计算其平均值和精密度，高、中、低浓度的准确度的变异系数分别为：1.15%，3.17%及6.52%。表明准确度较好。
3 讨论
本研究建立的HPLC -UV法采用对羟基苯甲酸甲酯作内标，先用氨水碱化血浆，然后用乙酸乙酯提取。所得氟康唑和内标对羟基苯甲酸甲酯色谱峰形对称且无肩峰，采用峰面积比对浓度回归，相关性较好。自动进样器的应用减少了人为误差，明显提高了效率和精确度。
本方法稳定性好，特异性高，信/ 噪比>3，无杂质干扰。方法稳定且精密度良好(误差<10%)，准确可靠，适用于氟康唑血浆浓度测定。
【参考文献】
1 王蔚青，张宏文，刘广余，等. 氟康唑胶囊剂的人体生物利用度及生物等效性研究. 抗感染药学， 2004，1(3)：110-114.
2 王雪丁，黄丽慧，曾桂雄，等. 氟康唑胶囊的人体药代动力学及其生物利用度比较. 中国临床药理学杂志，2002，18（3）：207-210.
3 王小林，季颖，江志强，等. 氟康唑胶囊的人体生物等效性评价. 中国临床药学杂志， 2003，12(5)：280-283.
4 邱相君，李艳，徐鹏，等. 两种氟康唑胶囊的人体生物等效性研究. 医药导报， 2005， 24(11)： 984-986.