细胞基因影响
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0引言钙敏感受体CaSR(calciumsensingreceptor)属于G蛋白偶联受体家族，是一个七次跨膜蛋白，其主要功能为维持钙离子的平衡，并且参与细胞间信号的传导，控制基因的表达、细胞凋亡以及细胞的增殖与分化［1，2］。CaSR参与许多种类良性和恶性肿瘤的形成与转移，比如乳腺癌、前列腺癌［3］、直肠癌［4］。据报道，在原发转移性乳腺癌细胞中，CaSR是高于正常水平表达的，导致癌细胞生物特征的改变和转移侵袭性的增加［5］。有数据表明大约75%的晚期乳腺癌患者会发生癌细胞向骨组织转移的危险［6］。不正常的CaSR表达是某些恶性肿瘤细胞发生转移的一个重要机制，因此CaSR基因在乳腺癌细胞的形成和转移中可能起着重要的作用［7］。本试验构建了干扰CaSR基因的RNA小片段表达载体，转染高表达CaSR基因的MDA－MB－231细胞，观察所构建的siRNA表达载体对CaSRmRNA和蛋白的表达影响。
1材料和方法
1.1材料
1.1.1实验材料乳腺癌细胞MDA－MB－231购自于中国科学院昆明细胞库，现由作者实验室保存;psiRNA载体购自Invivogen公司;E.coliDH5α菌株、GT116菌株由作者实验室保存。
1.1.2试剂卡那霉素购自广州威佳生物;G418、SybrGreenⅠ抗生素购自Invitrogen;BbsⅠ内酶购自Fermentas;胎牛血清购自四季青公司和Gibico公司;酵母提取物、胰蛋白胨购自OXIOID;T4DNA连接酶、总RNA提取试剂RNAisoPlus、RT－PCR试剂盒PrimeScript、rTaqDNA扩增酶购自Takara公司;DMSO购自Sigma公司;dNTP、脂质体转染试剂TransFast购自Promega公司，兔抗人CaSR蛋白一抗和鼠抗人β－actin一抗购自Pro-teintech，辣根过氧化物标记羊抗兔二抗、辣根过氧化物标记兔抗鼠二抗购自鼎国生物。
1.1.3仪器UniversalhoodSN型凝胶成像仪购自美国Bio－Rad公司;Step－OnePlusReal－TimePCR仪购自ABI公司;
1.1.4培养基细胞培养基L－15购自Gibco公司;大肠杆菌培养基:LB培养基，自行配制。1.2方法
1.2.1细胞培养人乳腺癌细胞MDA－MB－231用含有10%胎牛血清的L－15培养基，在37℃、5%CO2培养箱中培养。
1.2.2psiRNA－CaSR重组干扰质粒的的构建根据NCBI提供的序列(Genbank:NM_000388)设计RNA干扰序列，选取5’－AAGGAGATCGAGTTTCTGT－3’作为实验组的干扰序列，合成相应的DNA序列:sense:5’－TC-CCAAGGAGATCGAGTTTCTGTtcaagagACAGAAACTCGATCTC-CTTTT－3’，antisense:5’－CAAAAAAAGGAGATCGAGTTTCT-GTctcttgaACAGAAACTCGATCTCCTT－3’(斜体为靶向CaSR干扰序列)。经Blast分析该干扰序列与人的其他编码序列无同源性。选取5’－GAGTTAACGTGAGGTACTT－3’作为阴性对照干扰序列。所有序列由Invitrogen合成。寡核苷酸链经过退火形成双链，连接至经过BbsⅠ酶切过的psiRNA载体(Invivo-gen)。转化至E.coliGT116菌株保存。阳性干扰质粒命名为psiRNA－CaSR，阴性对照干扰质粒命名为:psiRNA－Scram-ble，空白对照质粒命名为psiRN－A(－)。
1.2.3质粒转染MDA－MB－231细胞转染前将细胞接种于12孔板，分为实验组、阴性对照组以及空白对照组。等细胞汇集度达到80%时，用TransFast脂质体转染2μg重组质粒，细胞培养基不填加血清，操作方法按照说明书进行。转染6h后用含有血清的L15培养基替代转染培养液。G418筛选转染阳性细胞株。
1.2.4RealTime－PCR检测CaSRmRNA表达MDA－MB－231细胞转染后，培养48h，空白对照(未转染组)采用相同培养条件。用TriZol提取细胞总RNA。cDNA合成采用cDNASynthesisKit(上海闪晶生物)，CaSR上游引物:5’－GGGCTCTTTCCTATTCAT’－3，CaSR下游引物:5’－GCTGTTTATCTCCTCTATG－’3。内参β－actin正向序列为:5’－TGACGTGGACATCCGCAAAG－3’，反向序列为:5’－CT-GGAAGGTGGACAGCGAGG－3’。荧光定量PCR:反应在RealTime－PCR仪进，采用SYBR－GreenⅠ作为染料，每个样品重复3次，StepOne软件(ABI)收集和分析实验数据。
1.2.5Western－Blot检测CaSR蛋白表达用Western－Blot方法检测CaSR基因蛋白表达的变化(以β－actin作为参照)。取转染后培养48h的实验组和对照组细胞，吸去培养基，PBS缓冲液冲洗细胞2次，加入冰预冷的细胞裂解液。冰上裂解15min，12000g、4℃离心5min，转移上清至新的离心管。取适量样品加入5×上样缓冲存液，进行SDS－PAGE电泳，分离胶浓度10%，浓缩胶浓度4%。电泳分离后蛋白采用半干电转移转移至硝酸纤维素膜上。用封闭液(5%脱脂奶粉，0.1%Tween20，溶于1×TBS缓冲液中)封闭30min，加入稀释的一抗(Rabbit，IgG，PTG公司1:1000)，4℃过夜，清洗缓冲液(PBS，1%TritonX－100，0.5%脱脂奶)清洗后，加入二抗，室温孵育2h。按照ECL试剂盒说明，X光片曝光成像。Bio－Rad成像仪分析图像。
1.3统计学处理所有实验数据用SPSS19统计软件处理。实验结果以Mean±SE表示，P＜0.05认为有统计差异。
2结果与分析
2.1构建质粒的鉴定
2.1.1重组质粒的鉴定psiRNA－hH1neo载体两个BbsⅠ酶切位点间含有EM7－alpha－peptide序列，质粒转化至大肠杆菌GT116中可利用蓝白筛选挑选阳性克隆菌株。未经酶切的原质粒和经过酶切构建的质粒在含有X－Gal的平板上呈现蓝色和白色。psiRNA－hH1neo质粒的两个BbsⅠ酶切位点之间的序列约为300bp，酶切插入合成的序列约为100bp左右，重组质粒相对原质粒分子量变小，琼脂糖电泳初步鉴定干扰质粒构建的正确性。
2.1.2质粒测序鉴定初步鉴定正确的重组菌株，培养提取纯化质粒，送至invitrogen进行测序，所得的测序结果与设计序列进行比对分析得知测序结果与所设计的相符，序列大小及插入方向完全正确，如图2所示。
2.2siRNA对CaSRmRNA水平表达的抑制效率Real－timePCR测定目的基因CaSR的表达水平，结果如图2所示。实验组与对照组比较，内参基因β－actinmRNA表达量无
2.3siRNA对CaSR蛋白水平表达的抑制提取分别转染了psiRNA－CaSRpsiRNA－Scramble的MDA－MB－231细胞总蛋白，Western－Blot结果显示:CaSR蛋白条带灰度差异显著，重组干扰质粒psiRNA－CaSR转染组CaSR蛋白表达水平明显低于对照质粒转染组。
3讨论
研究发现，CaSR基因在体内通过调节甲状旁腺激素(PTH)的分泌来维持钙离子的平衡，SandersJL等人研究发现在乳腺癌细胞中CaSR通过形成甲状旁腺相关激素(PTHrP促进乳腺癌细胞的转移［8］。ElHianiYassine等人报道高浓度的Ca2+激活CaSR基因能够促进乳腺癌细胞的增殖［9］。随着研究的深入，针对CaSR的化学药物已经产生，用于治疗与之相关的一些疾病［10］。1998年，Fire等人发现RNA干扰现象(RNAinterference)，现在RNAi技术很成熟地应用于研究特定基因表达领域。这项技术在生物科学、医学、制药等领域有着重要的作用［11］。RNA干扰作用可以通过把合成的相应片段注射到细胞中，也可以借助质粒或者病毒载体转染至细胞中来实现，质粒载体具有安全、易获得甚至多靶标等优点而得到广泛应用［12］。目前利用RNAi技术针对肿瘤治疗的药物已经产生，经有能力做到利用RNA干扰技术靶向沉默癌基因而不伤害正常细胞［15］。本实验构建表达shRNA(smallhairpinRNA)的质粒载体、特异性沉默CaSR基因。试验结果表明此干扰质粒可有效地抑制CaSR基因的表达，为以后的研究打下了基础。