实时聚合酶链反应诊断血吸虫病的效果分析

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【摘要】目的:建立一种敏感性、特异性高于Kato-Katz法的以聚合酶链(PCR)为基础的诊断方法,用于现场检测感染人群粪便中的血吸虫卵。结果:实时PCR法与非血吸虫卵无交叉反应;其敏感性明显高于三片Kato-Katz法 (>10虫卵/克粪样)。对258份现场粪样检查的结果表明,实时PCR法与Kato-Katz的阳性率比较,有显著性差异(P

【关键词】聚合酶链反应;血吸虫病; Kato-Katz法

【中图分类号】R532.21 【文献标识码】B 【文章编号】1006-1959(2009)09-0225-02

日本血吸虫病是一种严重危害我国血吸虫病疫区人民健康和影响疫区社会经济发展的地方寄生虫病。经过50多年的努力,血吸虫的防治工作取得了举世瞩目的成就。然而其流行受到诸多因素的影响,部分地区疫情有所回升。血吸虫病诊断在防治中占有重要地位,是确定化疗目标人群的依据。目前血吸虫病诊断的实验方法主要有两类:一类是病原学方法, 如Kato-Katz法[1];另一类是免疫学方法[2]。前者对中度和低度流行区粪样检测的敏感性较差;后者假阳性较高。聚合酶链反应(PCR),具有很高的特异性和敏感性,已被应用于多种传染病的临床诊断[3]。实时PCR是在传统PCR基础上发展而来的具有更高灵敏度和进行定量分析的优点。在临床分子诊断中具备广泛的应用前景。本文报道了一种用于检测血吸虫卵的实时PCR方法,并与Kato-Katz法一起对现场粪样进行了比较性检测分析。

1 材料与方法

1.1 样本来源:

①阳性样本:由阴性粪便加入已知数量新鲜血吸虫卵制备而成。

②现场粪样:选取两个血吸虫病中低度流行村,收集粪样258份。对每份粪样同时进行实时PCR法与Kato-Katz法检测;Kato-Katz法一粪三检。

1.2 DNA抽提:粪样中DNA经ROSE法提取[4]。每克粪样先与1ml蒸馏水混匀,离心(500rpm)2min,去上清液并再重复一次。剩下的沉渣与0.7ml的ROSE缓冲液混合(10mM Tris [pH=8.0], 300mmol/L EDTA[pH8.0], 1% w/v SDS 和1% w/v pvpp)摇匀。对以上混合样本在95℃加热20min,然后经高速(18000rpm)离心10min。上清液与10%体积的醋酸钠(pH5.5)混匀,然后加入1ml 96%的冷乙醇,混匀并置于冰上15min。然后离心(18000rpm)10min。去上清液,沉淀用70%冷乙醇洗一次,然后空气干燥DNA样本,最后溶于100μlTE缓冲液,并在60℃加热5min,可溶部分与等量蒸馏水混匀低温保存。

1.3 实时PCR反应:用于该PCR反应的引物为针对日本血吸虫线粒体NADH脱氢酶基因的多聚核苷酸。所选用的PCR扩增片段经BLAST检索,证实其核苷酸序列与已发表的所有六株中国血吸虫线粒体基因组中该片段完全同源。并与曼氏血吸虫以及其它基因序列中的序列不保守。引物为DRa:5′TTTAGATGATTTGGGTGTGCTAT3′, DRb:5′AACCCCCACAGTCACTAGCATAA3′。经优化后PCR反应程序为:50℃反应2min,90℃反应10min,然后进行40个循环(95℃, 15s和60℃, 1min), 结束时70℃ 10min。实时格式的结果检测由Line-Genz荧光定量PCR检测系统(杭州博日科技有限公司)完成。

在荧光强度的对数值对循环数的曲线图中,荧光强度的初始值设在0.01,而人为的基线设在了5-15个循环之间。DNA产物的融点分析确定融化温度为72℃,只有当反应物的荧光强度超过初始限度并且融点在正常范围才考虑为阳性。每份样本一式二份进行PCR反应。至少有一份反应呈阳性才被确定为阳性样本

1.4 Kato-Katz虫卵计数:按WS261-2006操作,每份标本制成三张Kato-Katz涂片,计算每克粪便虫卵数(EPG)。

2 结果

2.1 实时PCR的特异性和敏感性:为了确定实时PCR方法的敏感性,在血吸虫卵阴性粪样中加入已知数量的血吸虫卵,EPG分别为100,50,10,1,和0。每组取十份样本,一式两份:一份作实时PCR分析,另一份作Kato-Katz法虫卵计数(如图1)。当粪样中虫卵数大于50EPG时,两种方法检测率均为100%阳性;但当EGP小于10时,实时PCR法明显优于Kato-Katz法(P

为了进一步评估实时PCR法的特异性,我们对蛔虫卵和钩虫卵的阳性粪样同时进行了检测(如表2),结果显示仅含血吸虫卵的粪样呈阳性反应。

2.2 实时PCR法与Kato-Katz法检测现场样本的比较:为了探索实时PCR法的现场应用价值,两个血吸虫病中低度流行村共258份粪样。同时进行实时PCR法与Kato-Katz法检测(如表1所示)。当粪样中EPG超过50时,两种方法的敏感性无明显差别;当粪样EGP等于和小于50时,实时PCR法的阳性检出率明显高于Kato-Katz法(P

3 讨论

本文介绍了一种检测血吸虫的实时PCR法。本法可以检测到每克粪样仅含一个血吸虫卵的粪样,并与蛔虫卵、钩虫卵无交叉反应。对现场258份粪样的检测结果表明,该法明显优于Kato-Katz三片法。

PCR作为一种检测血吸虫病的方法最近已经有一些报道[5,6,7]。然而主要应用传统PCR法,其检测的敏感度仅稍高于Kato-Katz法。SIMONSES等最近报道了一个检测日本血吸虫的实时PCR法[5],该法能检测到每克仅含一个虫卵的粪样。我们报道的方法与其近似,均扩增日本血吸虫线粒体DNA的保守区,但具体片段不完全相同,我们建立的方法与其敏感度非常一致。

与Kato-Katz法比较,尽管实时PCR法成本较高,需要专门的仪器,目前尚难以在基层大规模推广,但其极高的敏感性和适用于高通量检测的特性,使其在对中低流行区人畜便粪、钉螺及受感染小学校学生的普查以及对血清抗体的阳性人群的确认,具有极高的潜在应用价值。还需要对其特异性和对其它一些样本的检测的可行性作进一步的研究调查。

我扩增的内容:尤其对各种症状与血吸虫病相似,用病原学和间接血凝等常规方法检测结果为阴性,在临床上难以确诊的疑似血吸虫病病人的排除有相当的应用价值。从长远看,由于近年来新型合作医疗在农村的开展,疫区就诊病人日渐增多,所以这种方法有必要在一些血吸虫病专科医院进行一些探索,使之造福于民。

参考文献

[1] Ebrahim A., H. El-Morshedy, E. Omer, S. El-Daly AND R. Barakat. Evaluation of the Kato-Katz Thick Smear and Formal Ether Sedimentation Techniques for Quantitative Diagnosis of Schistosoma mansoni Infection. Am. J. Trop. Med. Hyg., 1997, 57(6):706-708

[2] 张小萍.日本血吸虫病低度流行区血清学检测方法的研究进展[J].中国血吸虫病防治杂志 2005, 17(5):397-400

[3] Gyorgy Csako. Present and future of rapid and/or high-throughput methods for nucleic acid testing.Clinica Chimica Acta.2006, 363(1-2):6-31

[4] Lier T, Simonsen GS, Haaheim H, Hjelmevoll SO, Vennervald BJ, Johansen MV.Novel real-time PCR for detection of Schistosoma japonicum in stool. Southeast Asian J Trop Med Public Health. 2006 Mar;37 (2):257-64

[5] Driscoll AJ, Kyle JL, Remais J.Development of a novel PCR assay capable of detecting a single Schistosoma japonicum cercaria recovered from Oncomelania hupensis.Parasitology. 2005 Oct;131(Pt 4):497-500

[6] Gobert GN, Chai M, Duke M, McManus DP. Copro-PCR based detection of Schistosoma eggs using mitochondrial DNA markers. Mol Cell Probes. 2005 Aug;19(4):250-4

[7] 周钧,陶开华,李越希,等. 聚合酶链反应及基因芯片技术检测日本血吸虫的研究[J]. 中华流行病学杂志, 2004, 25(2): 154-157

作者单位:430300 湖北武汉市黄陂区血吸虫病防治所1

430300 湖北武汉市黄陂区人民医院2

533000 广西右江民族医学院体外诊断研究所3