中药秦艽提取物抑制人晶状体上皮细胞迁移的研究

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[摘要] 目的 为了验证中药秦艽提取物抑制培养的人晶状体上皮细胞迁移的作用，寻找防治后发障的新药物。方法 晶状体上皮细胞长成单层后，分别加入1000、500、250、125和62.5 mg/L的秦艽提取物，培养24 h，观察细胞毒性，确定药物的半数毒性浓度。细胞用1 mL加样器枪头划痕，分别加入100、10、1、0.1 mg/L秦艽提取物，培养24 h。对细胞进行照像，测出实验前后的细胞痕的宽度，计算出细胞迁移距离，测定药物的半数有效浓度及计算秦艽提取物的治疗指数。 结果 秦艽提取物半数细胞毒性浓度为421.7 mg/L。以秦艽提取物浓度对数与迁移距离做回归分析，结果显示相关系数为-0.966，有显著性差异（P = 0.034）。秦艽提取物的半数有效治疗浓度为0.38 mg/L。秦艽提取物治疗指数为1110。 结论 秦艽提取物可抑制晶状体上皮细胞的迁移，具有低毒、高效的特点，有望成为防治后发障的有效药物

[关键词] 秦艽提取物；晶状体上皮细胞；迁移；后发障

[中图分类号] R776.1 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2013）24-0001-03

后发障是白内障手术后二次致盲的主要原因，虽然Nd：YAG激光可治疗，但存在多种并发症，如黄斑囊样水肿、视网膜脱离和眼压升高等，因此，研究药物防治后发障具有实际意义。抗代谢药虽可抑制后发障的发生，但其毒副作用较多。研究发现，中药中有些具有抗炎作用的药物可抑制细胞的增殖，但对抑制细胞迁移方面的报道较少。本文中，我们发现秦艽提取物可抑制培养的人晶状体上皮细胞的迁移，有望成为防治后发障的有效药物。

1 材料与方法

1.1 实验药物

秦艽提取物。取秦艽，加8倍量水煎煮三次，每次1.5 h，滤过，合并滤液，滤液在50℃～60℃减压浓缩至相对密度为1.11～1.15，加乙醇使含醇量达80%，静置12 h，滤过，回收乙醇至无醇味，加水稀释至与药材量之比为2∶1，静置12 h，滤过，滤液加到已处理好的SP70大孔吸附树脂柱，树脂与药材量之比为1∶1.5，依次用5%、40%乙醇溶液（5倍柱体积，2倍柱体积/h）梯度洗脱，收集40%乙醇洗脱液，减压浓缩成稠膏，稠膏干燥，即得。

1.2 细胞和细胞培养液

人晶状体上皮细胞系（SRA 01/04）由本单位张炜研究员惠赠。F12/DMEM营养液（Hyclone）；胎牛血清、Hepes液、胰蛋白酶/EDTA和D-Hanks液（Gibco）；L-Glu（Sigma）；青霉素、链霉素（华北制药）。配制200 mL细胞培养液：F12/DMEM营养液165～185 mL，血清10～30 mL，双抗（青霉素2万U/mL，链霉素20 mg/mL）1 mL，L-Glu（200 mmol/L）1 mL，Hepes液2.5 mL。再加入胎牛血清，分别配成含血清为5%、10%和15%的细胞培养液备用。

1.3 人晶状体上皮细胞的培养

使用15%血清培养液进行传代培养，加D-Hanks液冲洗，胰蛋白酶/EDTA（0.25%胰酶、0.03%EDTA）作用2 min，吸出消化液，加入营养液，将细胞加入96孔培养板中继续培养。

1.4 药物细胞毒性的测定

96孔培养板的细胞长成单层后，加D-Hanks液冲洗，分别加入1000、500、250、125和62.5 mg/L的秦艽提取物的营养液，培养24 h，观察细胞毒性，确定药物的半数毒性浓度（IC50）。

1.5 比较不同浓度血清对细胞迁移的影响

96孔板中细胞长满后，用1 mL加样器枪头划痕，分别加入10%和5%的血清培养液，培养24 h，对细胞进行照像，测出实验前后的细胞痕的宽度，计算出细胞迁移距离。

1.6 秦艽提取物对细胞迁移的作用

96孔板中细胞长满后，用1 mL加样器枪头划痕，分别加入用含5%血清的营养液配制浓度为100、10、1、0.1 mg/L秦艽提取物，培养24 h，对细胞进行照像，测出实验前后的细胞痕的宽度，计算出细胞迁移距离，计算秦艽提取物的半数有效浓度（EC50）和治疗指数（TI）。

1.7 统计学处理

采用SPSS16统计学软件进行统计处理，血清对细胞迁移距离影响采用t检验，药物浓度与迁移的关系采用回归分析。

2 结果

2.1 秦艽提取物的毒性

不同浓度的秦艽提取物对细胞的毒性见表1，药物毒性随浓度的减少而降低，半数细胞毒性浓度（IC50）为421.7 mg/L。

2.2血清浓度对细胞迁移的影响

细胞培养液中不同血清浓度对晶状体上皮细胞迁移有一定的影响，24 h后，10%血清培养液细胞的迁移距离为（0.84±0.12），5%血清培养液细胞的迁移距离为（0.59±0.06），两者有显著性差异（P = 0.024），血清浓度越高，细胞迁移的距离越大。

2.3 秦艽提取物对细胞迁移的作用

加入药物后24 h，以5%血清实验，秦艽提取物在药物浓度为0、0.1、1、10和100 mg/L时，细胞迁移距离分别为0.61、0.53、0.45、0.14和0.06（图1、2和3）。以秦艽提取物浓度对数与迁移距离做回归分析，结果显示相关系数为 -0.966，有显著性差异（P = 0.034）。通过计算得出，秦艽提取物的半数有效治疗浓度（EC50）为0.38 mg/L。

2.4 药物的治疗指数（TI）

秦艽提取物治疗指数（TI）为半数毒性浓度（IC50）/半数有效浓度，结果为1110。

3 讨论

晶状体上皮细胞是晶状体中唯一细胞，是维持晶状体功能的主要部分，它与囊膜一起共同保护晶状体。正常情况下，晶状体上皮细胞不断向晶状体内部迁移，并转化为纤维细胞，形成晶状体皮质和晶状体核。白内障术后，由于细胞微环境的变化，使细胞产生增殖和迁移的倾向，结果造成后发性白内障的发生。

晶状体上皮细胞从解剖位置上可分为两种：赤道部细胞和前囊细胞。这两种细胞在后发性白内障的发生过程中起不同的作用[1]，赤道部细胞具有迁移能力，可沿后囊膜与人工晶体之间空隙迁移到后囊膜的中心部位。如果空隙狭窄，这些细胞较平坦；如果空隙较宽，细胞变成球形结构——珍珠样小体；如果空隙更宽，珍珠样小体可形成多层或巨型结构。前囊细胞在撕囊后保留下来，表现出移行的能力，但更具有向间质细胞转化的能力，引起胶原的吸附和沉积，导致前囊膜皱缩，造成囊袋闭锁。

后发障是白内障手术的主要后遗症，特别是儿童的后发障发病率还较高，为了减少后发障的发生，减轻患者的痛苦，研究防治后发障药物很有必要。

秦艽是龙胆科多年生草本植物，是治风湿关节痛、结核病潮热、黄疸等症的主药之一，《神农本草经》记载，“秦艽主寒热邪气，寒湿风痹，肢节痛、下水、利小便”。实验研究显示，秦艽提取物不但具有抗炎的作用[2]，而且还具有抗肿瘤[3]、抗病毒[4]和抗细菌[5]的作用。

我们的实验发现，秦艽提取物对人晶状体上皮细胞迁移有抑制作用，呈剂量相关性。另外血清浓度高，可促进细胞迁移，我们选择5%的血清营养液进行实验。龙胆苦苷是秦艽提取物的主要成分，占总量的50%以上，但我们的研究显示，龙胆苦苷对人晶状体上皮细胞的迁移无抑制作用，推测秦艽提取物抑制人晶状体上皮细胞迁移的作用来源于药物的其他成分。秦艽提取物抑制晶状体上皮细胞的迁移的机制可能与影响细胞黏附分子功能有关[6]。

防治后发障的药物只有进入眼内并作用于晶状体上皮细胞才能起作用，可在手术中将药物注射到前房，晶状体上皮细胞迁移可被前房内注射的bFGF反义寡核苷酸抑制[7]，也可将药物包裹在人工晶体上。Eibl等[8]将烷基磷酸胆碱包裹人工晶体植入眼内，可显著抑制晶状体上皮细胞迁移，减少后发障的发生。

综上，秦艽提取物毒性小，作用强，治疗指数高，如用于临床，可为防治后发障的发生提供新的药物。

[参考文献]

[1] Menapace RM. Prevention of Posterior Capsule Opacification[M]. In Kohnen T and Koch DD. Cataract and Refractive Surgery，Heidelberg，Springer，2005：101-122.

[2] Jia N，Li Y，Wu Y，et al. Comparison of the anti-inflammatory and analgesic effects of Gentiana macrophylla Pall. and Gentiana straminea Maxim，and identification of their active constituents[J]. J of Ethno-pharmacology，2012，144（3）：638-645.

[3] 汪海英，袁冬萍，李福安，等. 秦艽总苷对人肝癌细胞等几种肿瘤细胞的体外作用[J]. 青海医学院学报，2009，30（3）：173-176.

[4] 李永平，李向阳，王树林，等. 秦艽提取物抗病毒的药效学实验研究[J]. 时珍国医国药，2010，21（9）：2267-2269.

[5] 张永贵，杨凤琴，袁本香，等. 秦艽提取物体外抑菌实验研究[J]. 包头医学，2011，35（2）：85-86.

[6] Choi B， Kim J， Lee E，et al. Synthesized pyridine compound derivatives decreased TNF alpha and adhesion molecules and ameliorated HSV-induced inflammation in a mouse model[J]. Eur J Pharmacol，2011，657（1）：167-172.

[7] 刘宏伟，彭淑玲，周毅等. bFGF反义寡核苷酸抑制大鼠实验性晶状体损伤后晶状体上皮细胞的增殖和迁移[J]. 眼视光学杂志，2002，4（1）：14-17.

[8] Eibl KH，Wertheimer C，Kernt M，et al. Alkylphosphocholines for intraocular lens coating[J]. J Cataract Refract Surg，2013，39（3）：438-445.

（收稿日期：2013-05-21）