参莲提取物对M1巨噬细胞的影响

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[摘要] 该实验探讨参莲提取物对动脉粥样硬化发展中的m1巨噬细胞的影响。MTT法检测参莲提取物对RAW264.7细胞的毒性作用；γ干扰素（IFN-γ）及脂多糖（LPS）诱导RAW264.7细胞成M1型巨噬细胞，然后加入高、中、低剂量的参莲提取物（50，25，12.5 mg・L-1）作用，流式细胞术检测M1巨噬细胞膜分子CD86的表达，RT-PCR法检测M1巨噬细胞中iNOS和TNF-α mRNA的水平，ELISA法检测M1巨噬细胞上清中IL-6和TNF-α的含量。结果发现IFN-γ及LPS能诱导RAW264.7细胞极化为M1型巨噬细胞，M1巨噬细胞膜分子CD86的表达、细胞中iNOS和TNF-α mRNA的表达以及细胞分泌的IL-6和TNF-α的含量均有显著性地提高；参莲提取物各剂量均可抑制M1型巨噬细胞膜分子CD86、细胞中iNOS及TNF-α mRNA的表达，降低细胞分泌炎症细胞因子IL-6及TNF-α的含量。通过以上研究表明IFN-γ及LPS能诱导RAW264.7细胞极化为M1型巨噬细胞；参莲提取物对M1型巨噬细胞有一定的抑制作用。

[关键词] 参莲提取物； M1巨噬细胞；细胞因子；动脉粥样硬化

[收稿日期] 2014-03-19

[基金项目] 国家“重大新药创制”科技重大专项（2009ZX09301-005-2-4）；科技部科研院所技术开发研究专项（NCSTE-2007-JKZX-301）

[通信作者] 朱晓新，博士，研究员，从事中药药理学及药代动力学研究，Tel：（010）64015008，E-mail：

[作者简介] 周冰冰，硕士研究生，Tel：（010）64015008，E-mail：

巨噬细胞是第一个被认为与动脉粥样硬化（atherosclerosis，As）相关的炎症细胞，随着研究的不断深入，单核-巨噬细胞的可塑性和异质性成为研究者关注的焦点。巨噬细胞在体内外不同的局部微环境影响下，可分化为M1，M2型巨噬细胞[1-2]。M1型巨噬细胞又被称为经典激活的巨噬细胞（classically activated macrophage），诱导后能分泌大量的炎性细胞因子，参与抗原递呈，加速As的发展；M2型巨噬细胞被称为替代激活的巨噬细胞（alternatively activated macrophage），诱导后能高表达炎症抑制因子，抑制炎症反应，促进组织损伤修复[2-3]。M1和M2巨噬细胞在体内相互转化，其平衡影响着As的发展和转归[4-5]。

参莲（SL）提取物是以活血化瘀、清热解毒为法组方，用现代工艺制备而成的中药复方提取物。参莲提取物主要含丹参酮类、丹酚酸类及穿心莲内酯类等成分。动物研究结果表明，参莲提取物可明显局限As斑块面积，减轻病变程度；并可通过抑制炎性介质的产生和释放，减少黏附分子、趋化因子和生长因子的异常表达，阻断As炎症反应；同时细胞实验发现，参莲提取物对TNF-α诱导的THP-1单核细胞迁移、摄脂和分泌等环节均有不同程度的影响，对As疾病具有良好的预防和治疗作用[6-8]。本实验拟通过在体外诱导RAW264.7细胞成M1型巨噬细胞，并进一步观察参莲提取物对M1型巨噬细胞的影响，以期解释参莲提取物对As防治作用。

1 材料

1.1 试剂 RAW264.7细胞（北京大学医学部医学实验中心提供，ATCC公司）；参莲提取物由中国中医科学院中药研究所化学室提供（配比为丹参水溶性部分4.13%，脂溶性部分2.5%，穿心莲脂溶性部分2.82%）；DMEM培养基（Gibco公司，批号8113292）；胎牛血清（Hycione公司，批号AVF73692）；小鼠重组IFN-γ（Peprotech公司，批号101227）；LPS（Sigma公司，批号L2880）；Taq DNA多聚酶、dNTP等PCR试剂盒（Thermo公司，批号00129776）；TRIzol（Ambion公司，批号66206）；DEPC水（Soiarbio公司，批号20130805）；小鼠IL-6 ELISA检测试剂盒（联科生物公司，批号282307431）；小鼠TNF-α ELISA检测试剂盒（联科生物公司，批号220630942）；FITC标记的大鼠抗小鼠CD86抗体（Biolegend公司，批号105005）。

1.2 仪器 ELX800 Spectramax190 连续波长酶标仪（美国MDC 公司）；FACSCalibur流式细胞仪（BD公司）；AC85V-265V PCR仪（Coyote Bio公司）；DYY-6D电泳仪（北京市六一仪器厂）；Champgel 5500凝胶成像仪（Sagecreation公司）。

1.3 引物 本实验所用引物见表1，由北京三博远志生物技术有限责任公司合成。

2 方法

2.1 RAW264.7的培养与传代 RAW264.7细胞复苏后，以含10%胎牛血清的DMEM培养基，5%CO2，37 ℃恒温培养箱培养细胞，每隔24 h观察细胞状态并换液和传代，待细胞融合80%左右时进行传代，必要时以1∶2或1∶3传代，以维持细胞的良好生长状态。

2.2 MTT法检测参莲提取物对RAW264.7细胞的毒性作用 将生长状态良好的RAW264.7细胞以1×104细胞/100 μL/孔接种于96孔板中，待细胞完全贴壁且生长状态良好时加入不同剂量参莲提取物作用24 h，设置剂量分别为800，400，200，100，50，25，12.5，6.25 mg・L-1及空白对照组。药物作用完毕后，每孔加入10%的MTT 20 μL（5 g・L-1，即0.5%MTT），继续培养4 h后取出培养板，1 000 r・min-1离心10 min，小心吸去孔内培养液。每孔加入150 μL二甲基亚砜，置摇床上低速震荡10 min，使结晶物充分溶解。490 nm处检测各孔的吸光度（A）。同时设置空白孔（培养基、MTT、二甲基亚砜）。按公式计算细胞生长抑制率=（1-A实验/A对照）×100%。

2.3 M1型巨噬细胞的诱导刺激及参莲提取物的作用 干预前 12 h 以 1×105个/mL密度铺细胞于6孔板，以2 mL完全培养基培养。待细胞完全贴壁且生长状态良好时加入2.5 μg・L-1IFN-γ和200 μg・L-1 LPS共同刺激培养12 h，诱导M1型巨噬细胞的形成[9-10]。诱导后加入不同浓度的参莲提取物作用12 h，药物浓度根据IC50进行设置。

2.4 流式细胞术检测M1型巨噬细胞细胞膜CD86蛋白表达 诱导、药物作用后以细胞刮将细胞刮除，1×106个/管，PBS洗1次，100 μL PBS重悬，加入1 μL的FITC标记的大鼠抗小鼠CD86抗体，4 ℃避光共孵育30 min，PBS洗去游离的抗体，用300 μL PBS重悬后，流式细胞仪检测细胞表面CD86的表达。

2.5 总RNA的提取及RT-PCR 提取方法参照试剂盒说明书进行，向刺激12 h及后药物作用12 h的细胞中加入预冷的PBS清洗2遍，将6孔板中的PBS去除干净，加入800 μL的TRIzol，静置放置5 min后用吹打管吹打5次，移入1.5 mL离心管中，然后加入200 μL氯仿，混匀，室温静置10 min后13 000×g高速低温离心10 min，小心将上层水相移至不含RNA酶的1.5 mL离心管中加入500 μL异丙醇，振荡混匀。静置5 min，以11 766 r・min-1（13 000×g）高速低温离心10 min，小心移去上清，再往离心管中加入75%乙醇1 mL，震荡后以11 766 r・min-1高速低温离心5 min，重复2次。小心弃去上清，室温静置5～10 min使RNA沉淀恰好干燥，加水溶解。按照PCR试剂盒说明书，以逆转录进行cDNA第一链合成：将5.5 μL的水和RNA（1 μg）放入100 μL EP管内，置于冰上，使RNA终浓度为0.5 g・L-1，再加入Oligo（dt） 0.5 μL，轻轻混合均匀，短时间离心；将反应液置于65 ℃ 5 min，冰上1 min，短时间离心；按顺序加入：5×buffer 2 μL，RNasin 0.5 μL，DNTP 1 μL，逆转录酶 0.5 μL，轻轻混合均匀，短时间离心，将混合物置于42 ℃，60 min；70 ℃加热5 min，中止上述反应，置于冰上。然后以cDNA为模板扩增iNOS和TNF-α的基因编码片段，以鼠GAPDH为内参照，扩增条件如下： 94 ℃预变性5 min；94 ℃变性45 s，Tm退火45 s，72 ℃延伸45 s，30个循环；72 ℃延伸7 min。

2.6 ELISA检测参莲提取物对M1型巨噬细胞细胞因子分泌的影响 按照以上诱导方法，分别收集刺激后和药物作用后细胞培养上清。按照试剂盒说明操作（此试剂盒为预包被试剂盒），洗板2次后加入洗液浸泡15 min，将板内洗液扣除干净，加入培养上清50 μL，加入1∶50稀释的生物素标记检测抗体100 μL，室温孵育2 h后洗板6次，加入1∶100亲和素标记辣根过氧化物酶100 μL，室温孵育45 min后洗板6次，加入显色液100 μL，室温避光15 min左右加入50 μL终止液终止，10 min内于450 nm波长检测吸光度（A）。

2.7 统计学分析 采用GraphPad Prism 5.0软件和SPSS 17.0软件对数据进行统计分析，结果以±s表示，2组间差异比较采用t检验，多组间差异比较采用单因素方差分析，P

3 结果

3.1 诱导后RAW264.7细胞形态改变 诱导剂诱导RAW264.7细胞12 h及药物作用12 h后，倒置显微镜（10×40倍镜）下观察到细胞生长状态，正常组的细胞是半悬浮的圆形状态；12 h模型组的细胞明显诱导贴壁，形态发生很大改变，长出触脚，变成梭形或纺锤形，单个细胞均比正常组细胞变大；各给药组细胞均趋于正常，有部分细胞恢复为半贴壁的圆形细胞，见图1。

3.2 MTT法检测参莲提取物的细胞抑制作用 为得到参莲提取物对RAW264.7细胞合理的用药浓度，设置了8个不同浓度的参莲提取物组，分别为800，400，200，100，50，25，12.5，6.25 mg・L-1，孵育24 h。随着参莲提取物浓度的降低，对RAW264.7细胞的抑制作用降低，其抑制率逐渐降低。浓度过高药物的溶解度较差，对结果有一定的影响。求得的IC50为100 mg・L-1，最终设定药浓度为IC50的1/2倍为高剂量50 mg・L-1，中剂量为25 mg・L-1，低剂量为12.5 mg・L-1，见图2。

3.3 参莲提取物对M1型巨噬细胞表面分子CD86的影响 IFN-γ和LPS刺激RAW264.7细胞后，细胞膜表达CD86的细胞比率明显增加（P

3.4 参莲提取物对M1型巨噬细胞分子中iNOS及TNF-α mRNA表达的影响 与空白组比较，IFN-γ和LPS诱导12，24 h，RAW264.7细胞的iNOS，TNF-α mRNA表达均明显增加（P

3.5 参莲提取物对M1型巨噬细胞培养上清中IL-6和TNF-α含量的影响 IFN-γ和LPS刺激RAW264.7细胞后均明显增加细胞培养上清中IL-6和TNF-α的含量（P

4 讨论

早期，As被认为是动脉血管壁内脂类和基质纤维素的积累[11]，随着研究的不断深入，认为As属于一种慢性血管炎症性疾病，且炎症还是导致斑块破裂事件的基础[12-13]，而巨噬细胞与炎症反应密切相关。近年来，进一步的研究认为巨噬细胞的表型具有异质性和可塑性，而具有功能性的巨噬细胞可诱导极化为M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞[1-2]。本课题组前期研究结果表明，参莲提取物防治As效果卓著，可明显局限As斑块面积，减轻病变程度；并可通过抑制炎性介质的产生和释放，减少黏附分子和趋化因子的异常表达，阻断As炎症反应[14-15]。为进一步解释参莲提取物对As防治作用，本实验旨探讨参莲提取物对M1型巨噬细胞极化的影响。

本实验参考陈涛等[9]和Khallou-Laschet J等[10]的方法，均采用IFN-γ及LPS联合干预RAW264.7细胞，使诱导成M1巨噬细胞，此方法为较为公认的模型方法。M1巨噬细胞相关的表型指标较多，但较为明确的标志性指标较少。研究发现，在动脉粥样斑块初期有大量的CD86的阳性表达，其含量的高低与As的严重程度成正相关[16]。另有研究通过虫草素和阿糖腺苷对人工诱导的巨噬细胞表型的影响，发现虫草素和阿糖腺苷均能降低M1巨噬细胞CD86的表达[17]。因此，本实验将CD86作为分子标记物用于M1巨噬细胞的检测。

已有大量研究表明，M1型巨噬细胞可分泌IL-6，TNF-α，IL-12及IL-1β等炎性细胞因子。这些炎性因子能参与抗原递呈，表达iNOS 和活性氧（ROS），促进NO 等活性氧合成，进而参与炎症反应及病菌清除，促进As的发展[18] 。本实验通过观察参莲提取物对M1型巨噬细胞分泌的细胞因子IL-6和TNF-α的含量，以及iNOS及TNF-α mRNA的表达，探讨参莲提取物对M1型巨噬细胞极化的影响。

实验结果发现，IFN-γ及LPS干预RAW264.7细胞，能成功的使RAW264.7细胞在生长状态良好的情况下极化为M1型巨噬细胞，M1巨噬细胞模型中的细胞膜分子CD86、细胞分泌的细胞因子IL-6和TNF-α以及细胞中iNOS和TNF-α的含量均显著性的增加。不同浓度的参莲提取物均能明显降低M1巨噬细胞膜分子CD86的表达，同时降低M1巨噬细胞中iNOS及TNF-α mRNA的表达，并能降低M1巨噬细胞分泌的炎症细胞因子IL-6及TNF-α的含量。在造模的同时用药物进行干预，结果发现，不同浓度的参莲提取物同样能明显降低M1巨噬细胞分泌的炎症细胞因子的含量。综上所述，提示参莲提取物能降低M1巨噬细胞的表达，这对抑制炎症发展，以及As的进一步恶化有积极作用。

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