分析补心软脉颗粒质量标准的研究

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补心软脉颗粒为江苏省中医院院内制剂,由红景天、麦冬、山萸肉、水蛭、银杏叶、虎杖6味中药组成,具有补益心肾、化瘀通络的功能,临床用于气阴两虚、痰血阻络型冠心病心绞痛。本研究采用薄层色谱法对制剂中的麦冬、山萸肉、水蛭、银杏叶、虎杖进行定性鉴别,采用高效液相色谱法(HPLC)对制剂中红景天苷、马钱苷进行定量研究,为建立该制剂的质量控制方法提供参考依据。

1 仪器与试药

Waters 2695-2996高效液相色谱系统,2998PAD检测器, Empower工作站(Waters公司);色谱柱为Hedera C18(4.6 mm×250 mm,5 ?m);BP-211D型电子分析天平(德国赛多利斯公司);超声仪(SK6200H,上海科导超声仪器有限公司);939薄层制板器(重庆市南岸贝尔德仪器技术厂);凝胶成像分析仪(WD-9413A型,北京市六一仪器厂)。

红景天苷、马钱苷对照品为含量测定用,均购自于四川维克奇生物科技有限公司,批号分别为100826、111127;对照药材麦冬、山萸肉、水蛭、银杏叶、虎杖均购自中国药品生物制品检定所,批号分别为121013-200908、121495-200702、121061-200904、121160-201003、120980-201005;制剂所用饮片经检验,均符合2010年版《中华人民共和国药典》(一部)项下相关要求和规定。液相测定用甲醇为色谱纯,水为超纯水,其余试剂均为分析纯。补心软脉颗粒(江苏省中医院,批号121210、121215、121220,规格10 g/袋),阴性样品按补心软脉颗粒制备工艺自制。

2 方法与结果

2.1 薄层色谱鉴别

2.1.1 麦冬 取补心软脉颗粒10 g,加5%HCl 50 mL水解1 h,取出,趁热过滤,滤液放冷后用二氯甲烷萃取2次,每次50 mL,合并二氯甲烷液,挥干,残渣加甲醇1 mL溶解,作为供试品溶液;取缺麦冬的阴性样品,按供试品溶液制备方法制备麦冬阴性对照溶液;取麦冬对照药材3 g,加甲醇50 mL,超声处理30 min,滤过,滤液蒸干,残渣自“加5%HCl 50 mL”起同法制成对照药材溶液。吸取上述3种溶液各10 ?L,分别点于同一硅胶G薄层板上,以正己烷-乙酸乙酯-甲酸(4∶4∶1.6)的上层溶液为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,105 ℃加热至斑点清晰,置紫外光(365 nm)下检视。供试品色谱中,在与对照药材色谱相应位置上,显相同颜色的荧光斑点,阴性未见干扰。

2.1.2 山萸肉 取补心软脉颗粒10 g,加无水乙醇25 mL,超声30 min,滤过,滤液浓缩至5 mL,作为供试品溶液;取缺山萸肉的阴性样品,按供试品溶液制备方法制备山萸肉阴性对照溶液;取山萸肉对照药材1 g,同法制成对照药材溶液。吸取上述3种溶液各10 ?L,分别点于同一硅胶G薄层板上,以乙酸乙酯-乙醇-冰醋酸(50∶10∶1)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以5%香草醛硫酸溶液,105 ℃加热至斑点清晰,置日光下检视。供试品色谱中,在与对照药材色谱相应位置上,显相同颜色的斑点,阴性未见干扰。

2.1.3 水蛭 取补心软脉颗粒5 g,加无水乙醇50 mL,超声30 min,滤过,滤液浓缩至5 mL,作为供试品溶液;取缺水蛭的阴性样品,按供试品溶液制备方法制备水蛭阴性对照溶液;取水蛭对照药材1 g,同法制成对照药材溶液。吸取上述3种溶液各10 ?L,分别点于同一硅胶G薄层板上,以环己烷-乙酸乙酯(4∶1)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10 %硫酸乙醇溶液,105 ℃加热至斑点清晰,置紫外光(365 nm)下检视。供试品色谱中,在与对照药材色谱相应位置上,显相同颜色的荧光斑点,阴性未见干扰。

2.1.4 银杏叶 取补心软脉颗粒5 g,加甲醇25 mL,加热回流30 min,取出,趁热过滤,滤液蒸干,残渣加水25 mL使溶解,用二氯甲烷萃取2次,每次50 mL,合并水层液,挥干,残渣加甲醇5 mL溶解,作为供试品溶液;取缺银杏叶的阴性样品,按供试品溶液制备方法制备银杏叶阴性对照溶液;取银杏叶对照药材1 g,同法制成对照药材溶液。吸取上述3种溶液各5 ?L,分别点于同一聚酰胺薄膜上,以40%乙酸为展开剂,展开,取出,晾干,喷以3%AlCl3乙醇溶液,热风吹干,置紫外光(365 nm)下检视。供试品色谱中,在与对照药材色谱相应位置上,显相同颜色的荧光斑点,阴性未见干扰。

2.1.5 虎杖 取补心软脉颗粒5 g,加5%HCl 50 mL水解1 h,取出,趁热过滤,放冷,滤液用二氯甲烷萃取2次,每次50 mL,合并二氯甲烷液,挥干,残渣加二氯甲烷5 mL使溶解,作为供试品溶液;取缺虎杖的阴性样品,按供试品溶液制备方法制备虎杖的阴性对照溶液;取虎杖对照药材0.2 g,加甲醇50 mL,超声处理30 min,滤过,滤液蒸干,残渣自“加5%HCl 50 mL”起同法制成对照药材溶液。吸取上述3种溶液各10 ?L,分别点于同一硅胶G薄层板上,以石油醚-甲酸乙酯-甲酸(15∶5∶1)的上层溶液为展开剂,展开,取出,晾干,置紫外光(365 nm)下检视。供试品色谱中,在与对照药材色谱相应位置上,显相同颜色的荧光斑点,阴性未见干扰。

2.2 红景天苷及马钱苷含量测定

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取红景天苷与马钱苷对照品适量,加甲醇制备成浓度分别为145.12、41.56 ?g/mL的混合对照品储备溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 精密称取补心软脉颗粒约1.2 g,置具塞锥形瓶中,精密加入甲醇50 mL,称定质量,超声处理(频率53 kHz,功率280 W)30 min,取出,再称定质量,用甲醇补足减失的质量,摇匀,0.45 ?m滤膜滤过,取续滤液,即得。

2.2.3 阴性对照溶液的制备 按补心软脉颗粒制备工艺,分别制备缺红景天、山萸肉的阴性样品,按“2.2.2”项下方法制备阴性对照溶液。

2.2.4 色谱条件 Hedera-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 ?m);流动相:甲醇(A)-水(B);梯度洗脱:0~16 min 80%A,18~60 min 72%A;柱温30 ℃;流速1.0 mL/min;检测波长:红景天苷为275 nm,马钱苷为240 nm。在上述色谱条件下,各组分分离度良好。色谱图见图1、图2。阴性对照在各指标成分相应的保留时间处无干扰。

2.2.5 线性关系考察 分别精密量取上述混合对照品储备溶液1.0、1.5、2.5、4.0、5.0、6.0 mL于10 mL容量瓶中,加甲醇稀释并定容至刻度,摇匀。分别精密吸取上述6个混合对照品稀释液及混合对照品储备液20 ?L进样,测定并计算。结果红景天苷回归方程为Y=464 356X-13 091,r=0.999 5,线性范围为0.290 2~2.902 4 ?g;马钱苷回归方程为Y=2×106X-16126,r=0.999 4,线性范围为0.083 1~0.831 2 ?g。

2.2.6 精密度试验 精密吸取混合对照品储备溶液20 ?L,连续进样6次,记录红景天苷、马钱苷的峰面积,计算,结果峰面积的RSD分别为1.57%、2.48%,表明仪器精密度良好。

2.2.7 重复性试验 取补心软 脉颗粒(批号121210)约1.2 g,平行6份,精密称定,按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液,精密吸取上述供试品溶液5 ?L,按“2.2.4”项下色谱条件测定。结果红景天苷和马钱苷平均含量分别为2.907、0.966 mg/g, RSD分别为1.21%、1.68%,表明方法重复性良好。

2.2.8 稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液5 ?L,分别于配制后的0、4、8、12、24 h测定峰面积积分值,计算RSD值。结果红景天苷和马钱苷峰面积的RSD分别为1.94%、2.97%,表明处理后的供试品溶液至少在24 h内稳定。

2.2.9 加样回收率试验 取同一批已知含量的补心软脉颗粒(批号121210)约0.6 g,共6 份,精密称定,分别精密加入对照品红景天苷1.744 mg、马钱苷0.579 mg,按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液,精密吸取上述供试品溶液5 ?L,依法测定,计算红景天苷和马钱苷的加样回收率及RSD,见表1。结果表明,方法的准确性良好。

2.2.10 样品含量测定 取3批补心软脉颗粒样品,每批平行3份,每份约1.2 g,分别按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液,按“2.2.4”项下色谱条件进样测定,计算每批红景天苷和马钱苷平均含量。结果红景天苷为2.883~2.941 mg/g,马钱苷为0.952~0.979 mg/g,见表2。

3 讨论

本研究建立了补心软脉颗粒的质量控制方法,对处方中麦冬、山萸肉、水蛭、银杏叶、虎杖5味药进行了薄层鉴别。在麦冬的薄层鉴别中,曾参考了2010年版《中华人民共和国药典》方法,结果鉴别斑点不能实现分离。参考文献[1]方法,结果鉴别斑点分离良好。在银杏叶的薄层鉴别中,曾参考了2010年版《中华人民共和国药典》方法,结果黄酮鉴别斑点不能实现分离,参考文献[2]对展开剂进行了调整,结果鉴别斑点分离良好。

关于含量测定试验中的供试品溶液制备方法分别考察了水、50%甲醇、50%乙醇、70%甲醇、70%乙醇、甲醇和乙醇不同提取溶剂,以及超声、回流不同提取方法,发现采用甲醇超声30 min提取,2种目标成分提取效率均较高,且方法简单,成本较低。

红景天是方中君药,具有加快心肌收缩速度、增强心肌收缩力、降低平均动脉压的作用[3]。红景天苷是红景天的有效成分之一[4],与本方的治疗目的一致。山萸肉为方中臣药,环烯醚萜类是其主要有效成分[5],也与本制剂治疗冠心病心绞痛的目的一致。所以选择红景天苷、马钱苷作为补心软脉颗粒含量测定的指标成分。

因为所使用的高效液相色谱仪配备PAD检测器,可以调用不同的波长,所以,采用在指标成分各自最大吸收波长下对其进行定量,这样可以兼顾指标成分的吸收强度以及吸收峰的平稳程度,从而更好地控制制剂的质量。方法学考察表明,该方法专属性强、稳定性好、准确性高,可用于该制剂的质量控制。

参考文献:

[1] 容蓉,陈明强.复方天麻颗粒质量标准研究[J].时珍国医国药,2009, 20(2):456-458.

[2] 李爽,贾媛,马兴苗.芪葵颗粒定性定量方法研究[J].药物分析杂志, 2012,32(9):1564-1577.

[3] 姜敏辉,吴翔,曹卫军.红景天对心肌缺血损伤保护作用的实验研及临床应用[J].江苏医药,2005,31(5):369-370.

[4] 莫书荣,鲁波,连芳.红景天对心脏血液动力学及心肌收缩力的影响[J].中国临床康复,2005,9(11):204-206.

[5] 李芳丽,毕月玲.山茱萸的药理学研究进展[J].医学信息,2011,24(9):5965-5967