头花蓼愈伤组织诱导及分化

开篇：润墨网以专业的文秘视角，为您筛选了一篇头花蓼愈伤组织诱导及分化范文，如需获取更多写作素材，在线客服老师一对一协助。欢迎您的阅读与分享！

摘要：研究了2种外植体（叶片、茎段）、消毒方法、培养基种类、活性炭、植物生长调节剂等因素对头花蓼愈伤组织诱导及分化的影响。结果表明，最佳消毒方法为以0.15%HgCl2消毒叶片6min和10%NaClO消毒茎段9min；不同培养基诱导愈伤组织发生率依次为MS>1/2MS>B5；MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.3mg/L有利于愈伤组织形成；MS+6-BA 4mg/L+NAA 0.2mg/L有利于愈伤组织增殖；MS+6-BA 8mg/L+IBA 0.1mg/L有利分化，分化率为83.33%，产生不定芽平均数为5.1个。培养基中附加100mg/L活性炭，褐化率仅为6.80%，愈伤组织生长和分化效果较好。

关键词：头花蓼；叶片；茎段；愈伤组织

中图分类号 S58 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2013）17-21-04

花蓼（Polygonum capitatum Buch.-Ham.ex D.Don）别名四季红、铜矿草、石辣蓼、石莽草等，属蓼科蓼属多年生草本植物，我国主要分布于、广东、四川、湖北、广西、云南、贵州等省区，印度、越南也有生长，其中在我国有17种、7变种，资源十分丰富。头花蓼是一种理想的彩叶花卉植物[1]，具有较高的观赏价值，可作为垂直绿化、边坡护理、地被绿化和观花等的良好材料推广应用[2]；也是一种重金属耐受植物，在废弃地的植物重建、修复中具有广泛的应用价值；同时头花蓼全草均可入药，有清热解毒、祛风止痛、去腐生肌的作用[3-4]。

头花蓼需求量大且野生资源有限，快速繁育体系可以有效解决原料供应不足的问题。头花蓼组织培养方面，尤其是愈伤组织培育研究较少。毛堂芬[5]和龙祥友[6]分别以头花蓼带节茎段、茎尖为外植体进行组培快速繁殖。笔者以头花蓼的叶片、茎段为外植体，通过组织培养手段建立无菌培养体系，研究了不同类型外植体、消毒方法、培养基类型、活性炭、植物生长调节剂等因素对其愈伤组织诱导的影响，为头花蓼愈伤组织的培育提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 供试材料头花蓼采自重庆北碚缙云山，后栽植于西南大学园艺园林学院园林植物与栽培育种实验室，进行常规管理。

1.2 试验方法

1.2.1 2种外植体的最佳消毒方法筛选 摘取头花蓼刚展开叶片和不带芽茎，在流水下冲洗1h，用蒸馏水反复冲洗3次。在超净工作台上，先用75%酒精进行表面消毒处理10～20s，分组后分别用0.15%HgCl2溶液浸泡2、4、6、8、10min，以及10%NaClO浸泡3、6、9、12min。外植体消毒后，用无菌水冲洗5次，无菌滤纸吸干表面水分，用无菌刀将叶片切成0.3cm2的小块，茎段切成1cm左右的小段，在无菌的条件下接种在无激素的MS培养基中。每瓶接种3个外植体，接种10瓶，每组设3次重复。每3d记录外植体污染数和存活数一次，以30d为周期统计其污染率和死亡率。

1.2.2 愈伤组织诱导

1.2.2.1 3种培养基对愈伤组织诱导的影响 取已建立的无菌体系苗，将切取好的叶片、茎段分别接种于含有6-BA1.0mg/L，NAA0.3mg/L的MS、1/2MS、B5的3种培养基上。

1.2.2.2 6-BA与NAA组合对外植体愈伤组织诱导的影响 选择以上最佳培养基，分别以6-BA 0.5、1.0、2.0mg/L，NAA 0.3、0.5mg/L为外源激素采取两因素完全随机组合设计。每瓶接种3个外植体，接种10瓶，每组设3次重复。每3d观察记录一次，以30d为周期，统计不同外植体愈伤组织及生长状况。

1.2.3 愈伤组织增殖 无菌条件下，选取头花蓼生长旺盛的胚性愈伤组织，切取直径大小约为0.3cm的块接种于MS培养基，培养基附加外源激素6-BA 0、2.0、4.0mg/L，NAA 0.2mg/L。90d（期间继代2次）后，称取愈伤组织的重量，在80℃下进行烘干，测得干物质含量。

1.2.4 愈伤组织分化

1.2.4.1 活性炭对愈伤组织诱导的影响 分别添加0、100、500mg/L活性炭，在MS+6-BA 1.0mg/L+IBA 0.1mg/L的培养基上诱导，观察并记录活性炭对愈伤组织诱导的影响。

1.2.4.2 不同浓度6-BA对不定芽诱导的影响 无菌条件下，将增殖的愈伤组织取出切成直径大小约为0.5cm的块，分别转接到含有6-BA 0、2.0、4.0、6、8、10mg/L，IBA 0.1mg/L培养基上。

1.2.5 培养条件 除基本培养基和激素浓度筛选试验外，培养基均采用MS固体培养基。培养基中含蔗糖30g/L，琼脂6g/L，pH值为5.8，于121℃高温下灭菌20min。在光照强度1 600lx下光照16h/d，培养温度25℃。

1.2.6 统计指标 外植体污染率（%）=（外植体污染数/外植体接种数）×100

外植体死亡率（%）=（外植体死亡数/外植体接种数）×100

愈伤组织诱导率（%）=（形成愈伤组织的外植体数/接种外植体总数）×100

分化率（%）=（形成不定芽的愈伤组织块数/接种愈伤组织总数）×100

平均芽数=产生芽数/产生芽的愈伤组织数

2 结果与分析

2.1 2种外植体的最佳消毒方法筛选 由表1可知，对于0.15%HgCl2处理的叶片，消毒4～6min时，污染率急剧下降，消毒10min以后没有污染，消毒效果较好；消毒6～8min时，叶片死亡率增加明显，10min时叶片全部死亡。0.15%HgCl2处理茎段，消毒8min以后没有污染；消毒8～10min时，死亡率增加明显，10min时为98%。以10%NaClO处理2种外植体，经过实验分析也出现以上相似趋势。说明，采用0.15%HgCl2和10%NaClO处理头花蓼叶片和茎段2种外植体时，随处理时间的增加，其污染数目逐渐减少，污染率在降低；其存活数目逐渐减少，死亡率在增加。综合分析，在头花蓼愈伤组织培养过程中从外植体材料的低污染率和高成活率来考虑，最佳消毒方法为：以0.15%HgCl2处理叶片消毒6min，污染率为16.67%，死亡率为19%；以10%NaClO处理茎段消毒9min，污染率和死亡率均为13.33%。

2.2 愈伤组织诱导

2.2.1 3种培养基对愈伤组织诱导的影响 由表2可知，同一培养基条件下，叶片外植体愈伤组织诱导率普遍低于茎段愈伤组织诱导率，表明采用茎段作为外植体诱导愈伤效果较好。观察发现，不同培养基中的愈伤组织多呈红褐色，少带绿色，其中MS培养基中愈伤组织生长状况较好，且有少量芽点出现。在同等激素浓度下，头花蓼2种外植体愈伤组织诱导率最高的为MS培养基，叶片和茎段诱导率分别为74%和82%；1/2MS培养基次之；最低为B5培养基。

2.2.2 6-BA与NAA组合对外植体愈伤组织诱导的影响 由表3可知，在以上最佳培养基（MS）中，添加不同浓度的6-BA和NAA配比，结果表明：在NAA浓度相同条件下，愈伤组织诱导率随6-BA浓度增加逐渐上升，但当激素浓度超过最适数值时，愈伤组织诱导率有所下降。说明低浓度的6-BA处理有利于愈伤组织诱导，而高浓度又会抑制愈伤组织形成。NAA浓度随6-BA浓度的变化，也出现以上类似规律。愈伤组织诱导中，适宜浓度6-BA和NAA共同作用将有利于植物细胞脱分化，愈伤组织诱导率较高。编号2培养基中，叶片、茎段2种外植体的愈伤组织诱导率最高，分别为73.33%和86.67%，最佳配比浓度为6-BA 1.0mg/L+NAA 0.3mg/L。编号1、6培养基愈伤组织诱导率最差。

2.2.3 愈伤组织的诱导观察 观察发现，不同编号培养基对头花蓼外植体愈伤组织的诱导存在较大差异。叶片和茎段在接种7d左右，基部稍有膨大，伤口处开始变成红褐色，产生极少量愈伤组织。接种28d后，外植体颜色加深，呈现出红褐色，切口变皱，愈伤组织显著膨大。愈伤组织的形成过程受植物外植体种类、培养基种类及成分和培养条件等诸多因素的影响，合适的条件有利于愈伤组织诱导体系的建立。

2.3 愈伤组织增殖 由表4可知，将愈伤组织接种到不同浓度6-BA的增殖培养基中，只添加NAA时，愈伤组织分化出根，不表现出生长；同时添加6-BA和NAA，愈伤组织表现出分化和生长状态。当NAA浓度为0.2mg/L不变时，愈伤组织数量随6-BA浓度增加呈现增加趋势，由26.7%增加到86.2%，愈伤组织生长强于分化，生长趋于正常。说明仅有NAA时，有利愈伤组织分化，分化出气生根；6-BA与NAA提高到合适浓度时，有利于愈伤组织增殖。最佳增殖浓度配比为6-BA 4mg/L+NAA 0.2mg/L，增加率为86.2%，愈伤组织生长正常。

2.4 愈伤组织分化

2.4.1 活性炭对愈伤组织分化的影响 由表5可知，培养基中添加活性炭对头花蓼愈伤组织褐化起抑制作用，愈伤组织褐变率随活性炭浓度的增加呈现先降低后升高趋势。未添加活性炭时，褐化率为35.20%，且褐化出现在切口周围，程度严重；加100mg/L活性炭时，褐化率为6.8%，且褐化现象出现较少，并且程度较轻；加500mg/L活性炭时，褐化率为13.30%，褐化较严重，部分出现枯萎。说明活性炭对头花蓼愈伤组织的褐变有一定的抑制作用，须选择适宜的浓度。结果表明，加100mg/L活性炭效果最佳，褐化率仅为6.80%，愈伤组织生长和分化效果较好。

2.4.2 不同浓度6-BA对不定芽诱导的影响 由表6可知，培养基中6-BA和IBA配合添加将有利于愈伤组织不定芽分化。观察发现，6-BA浓度过低，愈伤组织会出现不定根；浓度过高时愈伤组织会褐化。IBA浓度在0.1mg/L时，随着6-BA浓度增加，不定芽分化指数呈现升高趋势。当6-BA浓度为8mg/L时，不定芽分化率最高，为83.33%；6-BA 6mg/L、10mg/L时，不定芽分化率次之，分别为63.33%和66.67%；6-BA 2mg/L时最低，分化率为16.67%。6-BA 6mg/L和8mg/L时，愈伤组织分化成不定芽的平均数最高，分别为5.2个和5.1个；其次为6-BA 10mg/L，愈伤组织分化成不定芽的平均数为4.6个。综合考虑，头花蓼愈伤组织不定芽诱导的最佳配合比为：6-BA 8mg/L+IBA 0.1mg/L，分化率为83.33%，不定芽平均数为5.1个。

3 结论

头花蓼外植体来源广泛，能作为材料长期用于诱导建立愈伤组织无性系。最佳消毒方法为0.15%HgCl2处理叶片消毒6min；10%NaClO处理茎段消毒9min，且以茎段为外植体诱导愈伤组织较叶片效果更好。

材料自身差异导致培养条件存在略微不同。实验发现MS培养基为最佳培养基，这与蔡能[7]报道相一致。在MS中添加6-BA 1.0mg/L、NAA 0.3mg/L有利于形成愈（下转55页）（上接23页）伤组织，同时发现MS+6-BA 4mg/L+ NAA 0.2mg/L为最佳增殖配合比。

活性炭对头花蓼愈伤组织的褐变有一定的抑制作用[8]。附加100mg/L活性炭效果最佳，褐化率仅为6.80%，愈伤组织生长和分化效果较好。以6-BA和IBA为激素配比，发现头花蓼愈伤组织不定芽诱导的最佳配合比为6-BA 8mg/L+IBA 0.1mg/L，分化率为83.33%，不定芽平均数为5.1个。

参考文献

[1]韦美玉，赵洪.一种有潜力的野生花卉[J].中国花卉盆景，2005（3）：8.

[2]杨剑虹，王成林，代亨林.土壤农化分析与环境监测[M].北京：中国大地出版社，2008.

[3]任光友，常风岗，卢秦琳，等.石莽草的药理研究[J].中国中药杂志，1995（2）：107-109，128.

[4]李孟林，梁斌，姚强，等.苗药―头花蓼研究综述[J].中国医院用药评价与分析，2005，5（6）：383-384.

[5]毛堂芬，朱英.药用植物头花蓼的组织培养快速繁殖[J].贵州农业科学，2008，36（5）：16-17.

[6]龙祥友，孙长生.头花蓼的组织培养与快速繁殖[J].植物生理学通讯，2008，44（1）：116.

[7]蔡能，易自力，黄丽芳.安祖花离体培养快速繁殖技术的优化[J].中南林学院学报，2005，25（3）：85-88.

[8]刘用生，李有勇.植物组织培养中活性炭的使用[J].植物生理学通讯，1994，30（3）：214-217. （责编：徐世红）