狐狸脑炎活疫苗(CAV―2C株)规模化生产工艺

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摘要 开展了狐狸脑炎活疫苗（cav-2c株）生产用毒种的制备与鉴定、狐狸脑炎活疫苗的制备，进行了狐狸脑炎活疫苗生产中关键工艺参数的优化和验证，建立了狐狸脑炎活疫苗规模化生产工艺。

关键词 狐狸；传染性脑炎；疫苗；生产工艺

中图分类号 S858.315.3 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2016）10-0253-02

Process to Produce Live Vaccine of Fox Encephalitis（CAV-2C Strain）

CHENG Yue-ning 1 ZHANG Miao 2

（1 Institute of Special Animal and Plant Sciences，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Changchun Jilin 130112；2 Jilin Teyan Biological Technology Limited Liability Company）

Abstract In the paper，the virus seed （CAV-2C strain） used for production live vaccine of fox encephalitis was prepared and evaluated，and live vaccine of fox encephalitis was prepared.In order to establish process to produce live vaccine of fox encephalitis in a large scale，optimization and validation of key processing parameters were also done in the study.

Key words fox；infectious encephalitis；vaccine；production process

为了解决狐狸脑炎活疫苗规模化生产的关键技术，开展狐狸脑炎活疫苗产业化配套技术研究，成功地解决了限制狐狸脑炎活疫苗产业化生产的关键问题，建立了狐狸脑炎活疫苗规模化生产工艺[1]。

1 生产用毒种的制备和鉴定

将基础毒种适当稀释，按1∶10的比例同步接种于犬肾传代细胞（MDCK）悬液中，置37 ℃条件下培养1～2 d，换入维持液继续培养4～5 d，细胞单层70%以上出现典型CPE时即可收获，-70 ℃保存备用。对生产毒种进行鉴定，结果见表1。生产毒种使用一般不超过20代。

2 犬肾传代细胞（MDCK）的制备

用MDCK进行疫苗生产，当MDCK细胞培养4～5 d时，倾掉培养液，加入细胞消化液，清洗1次，再加入适量消化液，消化10～20 min，吹打分散细胞，按1∶3比例进行细胞传代，即为MDCK细胞悬液，供疫苗生产用[2]。

MDCK细胞应符合以下标准：细胞应无细菌、霉菌及支原体污染；细胞在MEM营养液中37 ℃条件下培养，48 h内应形成单层；细胞原始代数为55～60代，基础代数为61～65代，生产使用代数不超过20代，供疫苗生产用。

3 狐狸脑炎活疫苗的制备

将制备好的MDCK细胞按体积的0.5%～1.0%加入犬腺病毒CAV-2C株生产用毒种，培养72～96 h细胞病变达70%时，收毒，冻融1次，作为疫苗的半成品。对疫苗半成品进行无菌检验和病毒含量检验。

配苗与分装：将检验合格的细胞培养液融化后，若干组混合成一批，同时用0.1 mol/L NaHCO3调整pH值为7.4，然后按一定比例加入明胶蔗糖保护剂及适量硫酸卡那霉素，充分混合均匀后定量分装于西林瓶中，5 mL/瓶[3]。

冻干和封口及贴标：分装后，立即移入冻干机内，-36 ℃以下速冻4 h，开真空泵升华，温度升至-2～0 ℃维持15～18 h，然后温度回升到27 ℃恒定维持4～5 h，并在真空下压塞。检验合格后逐瓶加贴标签，注明批号、生产日期等。

4 成品检验

每批疫苗成品按照检验使用量的3倍取样，每批取样不少于20瓶，一次性取全所有样品。1份用于检验，另2份作为留样备用。

按《狐狸脑炎活疫苗制造及检验试行规程》草案规定的方法进行物理性状、无菌检验、支原体检验、鉴别检验、外源病毒检测、安全检验、效力检验、病毒含量测定和中和抗体测定。

5 狐狸脑炎活疫苗生产中关键工艺参数的优化和验证

5.1 MDCK细胞制备适宜条件的筛选

采用不同细胞浓度和转瓶机转速进行细胞培养，优化MDCK细胞制备的适宜条件。试验中使用不同温度培养，通过显微镜观察和细胞培养观察确定了MDCK细胞制备的适宜条件。通过调整细胞浓度和转瓶机转速，确定35 ℃转机速度6～10 r/h及一个转瓶按照1∶3比例传代可制备良好的细胞单层[4]。

5.2 毒种适宜接种量和培养时间的优化

取狐狸脑炎活疫苗生产毒种，按培养液体积的0.25%、0.50%、1.00%、2.00%接种于细胞中，放置转瓶机上培养3～5 d，逐日观察病变，于48、60、72、84、96、108 h分别取样测定单位体积病毒含量；重复以上试验3次，优化试验条件。

狐狸脑炎活疫苗生产毒种按不同比例同步接种于细胞中培养3～5 d，逐日记录细胞病变并测定单位体积病毒含量，结果表明按1%～3%量接种病毒，细胞72～96 h出现70%以上细胞病变，病毒含量达到高峰，此时是病毒收获的最佳时机。3%接种组细胞病变出现过快，不利于病毒繁殖，因此选择1%～2%为适宜的接种浓度[5]。

5.3 狐狸脑炎活疫苗配制比例的优化

将检验合格的病毒液融化后，用0.1 mol/L NaHCO3调整pH值为7.4，然后将病毒液加入明胶蔗糖保护剂，体积比分别为4∶1、3∶1、2.5∶1.0、2∶1、1.5∶1.0、1∶1，充分混合均匀后定量分装于西林瓶中，每瓶装量为5 mL；分装后迅速进行冷冻真空干燥，溶解至原体积后测定病毒含量；重复以上试验3次，优化试验条件，2∶1时效果良好。

5.4 狐狸脑炎活疫苗生产中关键工艺验证

按照优化的生产工艺参数试生产12批狐狸脑炎活疫苗，按照成品检验结果进行检验和分析。经过成品检验12批疫苗均达到了疫苗质量标准。

6 狐狸脑炎活疫苗规模化生产工艺的确定

根据12批犬瘟热活疫苗生产验证总结，确定适宜的规模化生产工艺和生产周期；按照该工艺生产狐狸脑炎活疫苗20批，并进行工艺总结。狐狸脑炎活疫苗规模化生产工艺流程：首先进行正常MDCK传代细胞培养，2～3 d后对传代细胞进行消化，分成多个培养瓶，在无菌条件下同步接毒种，之后送入转瓶机上，温度35 ℃，培养时间3～4 d，经检测细胞病变达70%时收获冻存，冻存温度-20 ℃，半成品检验合格，备用。

通过控制培养温度、细胞浓度、毒种使用浓度、疫苗配制比例等环节的技术问题，成功地解决了限制狐狸脑炎活疫苗产业化生产的关键问题，建立了狐狸脑炎活疫苗规模化生产工艺；通过20批狐狸脑炎活疫苗生产工艺总结，建立了成熟的狐狸脑炎活疫苗规模化生产工艺，为狐狸脑炎活疫苗产业化奠定了基础。

7 参考文献

[1] 闫喜军，姜莉莉，柴秀丽，等.狐传染性脑炎活疫苗抗体消长规律的研[J].经济动物学报，2006，10（2）： 70-72.

[2] 程世鹏，杨汉春，吴威，等.狐犬瘟热、细小病毒性肠炎和脑炎三联活疫苗免疫效力试验[J].中国兽医杂志，2008，43（8）：28-29.

[3] 王斐，单雪峰，戴长河，等.水痘减毒活疫苗生产工艺研究[J].中国新药杂志，2012，21（10）：1175-1177.

[4] 柴秀丽，闫喜军，姜莉莉，等.狐狸传染性脑炎活疫苗中和试验检测方法的建立和应用[J].特产研究，2006（4）：8-10.

[5] 郭红梅，王成.幼狐脑炎母源抗体消退情况监测[J].中国动物检疫，2014，31（2）：77-78.