β2糖蛋白I纯化及其稳定性分析

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作者：黄宏亮, 周红， 王婷， 石文霞, 李娜， 王海波

【摘要】 目的： 从正常人混合血浆中纯化获得β2糖蛋白ⅰ（β2gpi），并对提纯蛋白的纯度及稳定性进行分析。方法： 采用hclo4沉淀、heparin sepharose cl?6b亲和层析柱等纯化β2gpi；利用sds?page、蛋白质印迹分析提纯蛋白的纯度；观察不同温度、nacl浓度及防腐剂等条件下的β2gpi稳定性。结果： 本法获得了高纯度目的蛋白β2gpi（＞95%）。 β2gpi在浓度低于0.8 mol/l 的nacl溶液中，置室温及4℃保存易降解变性，但在1.6 mol/l nacl溶液中于室温及4℃保存60天均未见蛋白明显降解。结论： 利用本法能够得到高纯度的β2gpi，在使用和保存β2gpi时要考虑到其降解的可能性，注意保存条件，必要时冻干保存。

【关键词】 β2糖蛋白i；蛋白纯化；蛋白稳定性

［abstract］ objective: to purify β2?glycoprotein i(β2gpi)from normal human plasma and analyze its purity and stability. methods： β2gpi was purified by heparin sepharose cl?6b affinity chromatography following by hclo4 precipitation. the purity of the isolated β2gpi was identified by sds?page, western blot analysis. and it′s stability was observed under different temperature, concentration of salt and antiseptics. results： β2gpi was harvested using above methods and it′s purity was confirmed more than 95%. the protein maintained in the concentration of lower than 0.8 mol/l nacl might be degraded at room temperature even though at 4℃. but it was obviously stable when it was maintained in 1.6 mol/l nacl at room temperature or 4℃. conclusion： human β2gpi with high?purity from the plasma can be obtained by our methods. it is important to protect β2gpi from denaturazation in the process of conservation and regular use. it is the best way to dry the protein into powder for keeping β2gpi long time.

［key words］ β2gpi； protein purification； protein stability

β2糖蛋白i(β2?glycoproein i, β2gpi)又称载脂蛋白h，是由326个氨基酸组成的相对分子质量约为50 kd的血浆单链糖蛋白，其结构由5个补体调控蛋白样结构区（i～v）组成。在正常人血浆中， β2gpi 含量约为200 mg/l，其中60 %左右呈游离状态。 β2gpi与三酰甘油及肝素等具有高度的亲和作用，能激活脂蛋白脂酶，参与脂代谢等［1］。近年来， β2gpi及其抗体在抗磷脂综合征病理机制中的作用受到极大关注。研究发现， β2gpi是抗磷脂抗体的主要靶抗原，其抗体的产生在抗磷脂综合征的血栓形成中发挥着重要的作用［2，3］。然而， β2gpi及其抗体促血栓形成的具体机制还未完全阐明。本研究组近年来一直在进行这方面的探讨工作， β2gpi及其抗体是该研究工作的必备条件。因此，首先要纯化出β2gpi蛋白，并分析其特性，为深入的机制研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

正常人混合血浆由镇江市中心血站提供。heparin sepharose cl?6b亲和层析柱购自瑞典amersham biosciences公司；蛋白标准参照物购自立陶宛fermentas公司； β2gpi标准品购自美国usbio公司；抗β2糖蛋白i单克隆抗体（mab1066）购自美国chemicon公司；hrp标记的羊抗鼠二抗购自博士德生物工程有限公司；丙烯酰胺、双叉丙烯酰胺、sds和aps均购自美国amresco公司；chemidoc xrs凝胶成像系统购自美国bio?red公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 方 法

1.2.1 血浆标本处理 100 ml正常人混合血浆中加入2.5 ml的2％nan3（终浓度0.05％）,然后加入2.5 ml的70％hclo4，4℃搅拌30 min, 10 000 r / min离心30 min，取上清，用na2co3调ph至8.0，转移至透析袋中用0.02 mol/l tris?hcl / 0.03 mol/l nacl(ph8.0)的缓冲液4℃透析后备用（s1）。

1.2.2 层析柱准备 称取heparin sepharose cl?6b 1g溶胀于50 ml的0.02 mol/l tris?hcl / 0.03 mol/l nacl(ph8.0)缓冲液中，弃去上层悬浮小颗粒。处理好的填料灌入玻璃层析柱（避免气泡）后，用以上相同缓冲液洗涤平衡后备用。

1.2.3 上样平衡 将上述处理过的样本（s1，约20 ml）小心加到heparin sepharose cl?6b亲和层析柱床面上，待样品刚好渗入到柱中，用0.02 mol/l tris? hcl / 0.03 mol/l nacl(ph8.0)平衡液洗脱至流出液d（280 nm）值达到基线，流速36 ml / h，收集上样平衡流出液（s2）。

1.2.4 洗脱收集 用洗脱i液 ［0.02 mol/l tris? hcl / 0.15 mol/l nacl(ph8.0)］和洗脱ⅱ液［0.02 mol/l tris?hcl / 0.35 mol/l nacl(ph8.0)］进行分步洗脱，流速36 ml / h，每1 ml收集样本,并检测每管d（280 nm）值。

1.2.5 蛋白鉴定 （1）sds?page电泳鉴定。将s1,s2及各洗脱峰收集样本经12 %sds?page电泳,观察各收集液蛋白条带，另加白蛋白(alb)样本作为鉴别对照。在基本认为洗脱ⅱ峰蛋白为目标蛋白后，将洗脱ⅱ峰蛋白、 β2gpi标准品及两者混合样本进行sds?page电泳，进一步确定是否为目标条带以及是否有杂带。（2）蛋白质印迹鉴定。分别取纯化蛋白、 β2gpi标准品各2 g经sds?page电泳后，转至pvdf膜上，用鼠抗人β2gpi单克隆抗体（mab1066）和hrp标记的羊抗鼠的二抗分别孵育后，ecl荧光显色，凝胶成像系统记录结果。

1.2.6 蛋白稳定性分析 重点观察不同温度、盐浓度、防腐剂及酶抑制剂对纯化蛋白稳定性的影响。温度的影响：将蛋白置于室温, 4℃及-20℃下，存放20,40,60 d后，sds?page观察蛋白条带有无变化。nacl浓度的影响：观察蛋白在不同浓度nacl（0,0.2,0.4,0.8和1.6 mol/l）中，随着存放时间的延长是否有变化。防腐剂及酶抑制剂的影响：分别观察蛋白在含有nan3或pmsf的情况下，存放不同时间后有无变性、降解等。观察方法采用sds?page电泳。

2 结果

2.1 蛋白纯化

正常人混合血浆经hclo4沉淀后获得的粗品（s1）为透明澄清的液体。调节粗品ph并透析后上样，平衡液洗脱至流出液d（280 nm）值达到基线，共收集到55 ml平衡收集液（s2），在随后的分步洗脱中，洗脱ⅰ和洗脱ⅱ各获得一个洗脱峰（图1）。

图1 hclo4沉淀后样品过heparin sepharose　cl?6b亲和层析柱分步洗脱收集峰（略）

fig 1 eluted peak of the supernatant of sera precipitated　by hclo4 passed through heparin sepharose　cl?6b affinity column

2.2 sds?page结果

选择样本s1，s2,洗脱i峰的a，b，c， 洗脱ⅱ峰a，b，c，d进行sds?page电泳,结果见图2。粗纯品s1有3个条带，上方条带与白蛋白相近，相对分子质量约66 kd,下方还有2个条带，相对分子质量分别约为50 kd，45 kd；上样平衡收集液s2出现的条带与s1基本一致；洗脱ⅰ收集液中与肝素柱结合不强的白蛋白和其他一些杂带首先被洗脱下来；洗脱ⅱ收集液中b，c，d相对分子质量相同，为肝素亲和蛋白，系同一种蛋白，chemidoc xrs凝胶成像系统扫描该蛋白条带纯度高达95％以上。进一步将洗脱ⅱ收集的蛋白标本c 2 g， β2gpi标准品2 g及两者混合样本经过sds?page电泳，结果表明条带位置一致，浓度一致，相对分子质量约为45 kd（图3）。

alb：白蛋白； s1：hclo4沉淀后标本； s2：上样平衡流出液；a,b,c:图1洗脱峰i对应标本； a,b,c,d：图1洗脱峰ⅱ对应标本

图2 提纯各步骤收集液sds?page电泳鉴定（略）

fig 2 sds?page analysis of the fractions collected during　different steps of purification

m:蛋白标准参照物； 1： β2gpi标准品(2 g) ；2：标准品(2 g)+洗脱峰ⅱ?c标本(2 g)； 3：洗脱峰ⅱ?c标本(2 g)

图3 纯化蛋白的sds?page(12%)电泳鉴定（略）

fig 3 identification of purified protein on 12%　sds?page

2.3 蛋白质印迹结果

应用单克隆抗人β2gpi抗体对提纯蛋白（2 g）进行蛋白质印迹，以β2gpi标准品（2 g）作为阳性参照。结果出现与β2gpi标准品相同的阳性反应条带，并且阳性带浓度一致（图4）。

s： β2gpi标准品(2 g)； 1：洗脱峰ⅱ?c标本(2 g)

图4 蛋白质印迹分析图（单克隆抗人 2gpi抗体）（略）

fig 4 western blot analysis(by anti?human 2gpi mab)

2.4 蛋白稳定性

图5中的a，b，c显示室温下， β2gpi蛋白于不同浓度nacl溶液中存放20，40和60 d的情况，d，e，f是在4℃条件下不同浓度nacl溶液中存放20，40和60 d的情况。无论是室温还是4℃， β2gpi蛋白在低于0.4 mol/l nacl溶液中易分解成小片断，可见电泳图上在目标蛋白下方出现相对分子质量较小的条带，且随存放时间延长会出现更低相对分子质量的条带，甚至目标条带完全消失。在0.8 mol/l nacl溶液中蛋白可于室温保存40天，保存60天则蛋白降解。在1.6 mol/l nacl溶液中β2gpi蛋白稳定性好，室温及4℃存放60天均未见降解条带。

图5 提纯蛋白在不同浓度nacl,不同温度,保存不同时间后蛋白电泳分析图（略）

fig 5 electrophoresis results of purified protein under different concentrations of nacl, temperature and periods

3 讨论

研究表明，在体外β2gpi具有抗凝血功能，可以抑制血小板凝血酶原活性、抑制adp诱导的血小板聚集过程及vwf依赖的血小板的黏附和聚集［4］，在体内β2gpi及其抗体在抗磷脂综合征的病理过程中发挥重要作用。β2gpi与其抗体形成复合物可刺激血管内皮细胞、血小板、单核细胞表达各种炎性因子、促凝蛋白等，从而引起高凝状态。然而， β2gpi及其抗体是通过何种通路引发这些因子的表达尚未清楚，也是抗磷脂综合征药物治疗的关键，尚需深入地研究。在进行β2gpi及其抗体的研究中，如何获得高纯度的β2gpi蛋白是关键步骤。 β2gpi来源较困难，国内无商品化产品供应，进口产品价格昂贵，且购买周期长，难以满足研究的需要。人血浆中β2gpi含量丰富，如果能将其纯化出来，是很好的来源渠道。为此，本文建立了一种快速简便的提纯人血浆β2gpi的方法。主要步骤是高氯酸沉淀、heparin sepharose cl?6b柱亲和层析，必要时再经过deae sephadex a50离子交换柱层析。

我们的经验是，在提纯的第一步，70％hclo4沉淀血浆蛋白非常重要。hclo4室温下易分解，70％hclo4必须新鲜配制。新鲜配制的70％hclo4沉淀血浆所获得的蛋白中仅存白蛋白和另一未知杂蛋白，其他杂蛋白含量甚少，在上样平衡及洗脱i过程中可将杂蛋白完全洗脱下来。再经洗脱ⅱ液洗脱，即可获得目标蛋白，提纯的蛋白和等量的标准品经蛋白电泳出现浓度一致的条带，利用quantity one 软件分析此电泳条带纯度高达95%以上。上样量相同的纯化蛋白和标准β2gpi 在蛋白质印迹分析时，结果条带位置及浓度一致，表明提纯的蛋白确为β2gpi。将提纯的蛋白与抗β2gpi抗体共孵育单核细胞株thp?1细胞，能提高细胞组织因子表达量（结果未显示），提示所纯化蛋白为β2gpi，与其抗体形成复合物，对单核细胞具有刺激作用，为进一步的机制研究奠定了基础。

另外，本研究组在使用和保存该提纯蛋白时发现其结构不稳定，易降解消失。于是我们设定不同温度、不同盐浓度以及有无pmsf或nan3的条件，观察该蛋白存放不同时间后的变化。结果发现， β2gpi保存在低温及高盐状态时稳定性好，在浓度≤0.4 mol/l nacl溶液中室温保存极易分解，在浓度0.8 mol/l nacl溶液中蛋白可于室温保存40天，在浓度1.6 mol/l nacl溶液中保存时间可以延长至60天。另外，观察了防腐剂nan3和蛋白酶抑制剂pmsf对β2gpi蛋白在不同温度、存放不同时间的情况。结果表明，在室温下pmsf对β2gpi蛋白无保护作用，而nan3具有较好的保护效果。4℃及-20℃条件下pmsf和nan3均具有保护作用（结果未显示）。这提醒我们该蛋白的提纯过程应尽量在低温下快速完成，并加以适量的nan3进行保护。在保存和使用该蛋白时要避免在4℃以上长时间存放，建议置-20℃保存或制备成冻干粉长期保存。

【参考文献】

［1］ hasununa y, matsuura e, makia z. involvement of beta?2?glycoprotein i and anticardiolipid antibodies in oxidatively modified low?density lipoprotein uptake by macrophages［j］. clin exp immunol, 1997, 107(3): 569-573.

［2］ kajiwara t, yasuda t, matsuura e. intracellular trafficking of β2?glycoprotein i complexes with lipid vesicles in macrophages: implications on the development of antiphospholipid syndrome［j］. j autoimmun, 2007, 29(2/3): 164-173.

［3］ ostertag mv, liu x, henderson v, et.al. a peptide that mimics the vth region of beta2?glycoprotein i reverses antiphospholipid?mediated thrombosis in mice［j］. lupus, 2006, 15(6): 358-365.

［4］ hulstein jjj, lenting pj, de laat b. beta 2?glycoprotein i inhibits von willebrand factor?dependent platelet adhesion and aggregation［j］. blood, 2007, 110(5): 1483-1491.