转染微小RNA―132对骨肉瘤SaOS―2细胞生长和凋亡的作用
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摘要：目的 观察转染微小rna-132 （miR-132）对体外人骨肉瘤细胞株SaOS-2生长和凋亡的影响，并初步探讨其作用机制。方法 实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应（RT-qPCR）检测34例骨肉瘤组织及癌旁正常组织中miR-132 mRNA的表达；Cell Counting Kit-8 （CCK-8）法检测细胞增殖；细胞经DAPI染色后在荧光显微镜下观察细胞凋亡；Western blot检测体外SaOS-2细胞中Mucin-4、HER-2和p-FAK蛋白的表达。结果 miR-132 mRNA在骨肉瘤组织中的表达明显低于癌旁正常组织，差异有统计学意义（P < 0.05）；与对照组相比较，转染组细胞中miR-132 mRNA的表达明显升高，细胞殖被明显抑制，凋亡细胞显著增加，差异均有统计学意义（P
关键词：骨肉瘤；miR-132；凋亡
Effects of MicroRNA-132 Transfection on the Proliferation and Apoptosis in Osteosarcoma SaOS-2 Cell Line in Vitro
ZHOU Qi
（The First People Hospital of Yueyang，Yueyang 414000， Hunan，China）
Abstract：Objective To observe the biological role and underlying mechanism of miR-132 in osteosarcoma proliferation and apoptosis. Methods The expression of miR-132 mRNA in the cancer tissue and their adjacent tissues in 34 osteosarcoma patients were detected by real-time quantitative polymerase chain reaction （RT-qPCR）. The biological effects of miR-132 transfection on osteosarcoma SaOS-2 cells were assessed by CCK-8 assay and DAPI staining. Western blotting was used to detect the expression of Mucin-4， HER-2 and p-FAK in SaOS-2 cells. Results The expression level of miR-132 mRNA was found to be downregulated in osteosarcoma tissues compared with the matched adjacent tissues. After transfection， the expression of miR-132 mRNA was significantly higher than control group. The proliferation of SaOS-2 cells was inhibited significantly by miR-132 transfection. Apoptosis rate induced by the miR-132 transfection was markedly higher than that of control. The proteins of Mucin-4， HER-2 and p-FAK were decreased after miR-132 transfection. Conclusion miR-132 is downregulated in osteosarcoma tissues， transfected of miR-132 can effectively inhibit proliferation and promote apoptosis of SaOS-2 cells in vitro， miR-132 may become a new target for the regulation of gene expression in osteosarcoma.
Key words：Osteosarcoma； miR-132； Apoptosis
1引言
骨肉瘤为最常见成骨性恶性肿瘤，多发于青少年，极易复发转移，当前基因治疗逐渐成为恶性肿瘤治疗的前沿。微小RNA（microRNA， miRNAs）是一种内源性非编码小分子RNA，在组织炎症反应、细胞增殖与凋亡、组织分化以及恶性肿瘤发生和发展等多种生理过程中发挥着重要的作用[1]。其中miR-132是当前研究热点之一，miR-132不仅在结肠癌和胰腺癌等多种恶性肿瘤细胞中表达下调，同时与恶性肿瘤的转移有着密切的关系[2， 3]，表明miR-132可能作为抑制恶性肿瘤的新作用靶点。为进一步明确miR-132调控恶性肿瘤生物学行为中的作用机制，本研究运用PCR技术观察miR-132 mRNA在骨肉瘤组织和癌旁正常组织中的表达差异，并通过转染miR-132至骨肉瘤细胞，检测其对体外骨肉瘤细胞增殖和凋亡的影响，探讨miR-132作为治疗骨肉瘤新靶点的价值。
2资料与方法
2.1 一般资料 34例骨肉瘤组织标本取自2008年06月～2013年9月在我院骨外科行手术切除的骨肉瘤及对应的癌旁正常组织手术标本。其中男性11例，女性23例，年龄12～45岁，中位年龄23.6岁，所有病例均术后经病理检查证实为骨肉瘤，术前均未行放化疗，全部标本取材后迅速置于- 80℃冰箱保存备用。
2.2 主要试剂 胎牛血清、RPMI-1640培养基和含0.25%EDTA胰蛋白酶购自美国Gibco公司；CCK-8试剂盒和BCA蛋白浓度测定试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司；Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒购自美国Sigma公司；Mucin-4、HER-2、p-FAK、FAK和β-actin抗体购自美国Santa Cruz公司；CyTM3标记miRNA-132 mimic购自锐博生物科技有限公司；SYBR实时荧光定量试剂盒、Hairpin-itTM miRNAs qPCR Quantitation Kit、U6 snRNA real-time PCR Normalization Kit和脂质体LipfectamineTM 2000购自美国Invitrogen公司。
2.3 细胞培养 人骨肉瘤细胞株SaOS-2购自ATCC，细胞培养在含l0%胎牛血清、质量浓度1×105 U/L青霉素和100 mg/L链霉素的RPMI-1640培养液中，置于37℃、5%的CO2的培养箱内培养，2～3 d换液1次，细胞单层贴壁生长至70%～80%融合时胰蛋白酶消化传代。
2.4 RT-qPCR检测肿瘤组织中miRNA-132的表达 用Trizol试剂提取肿瘤组织及癌旁正常组织中的总RNA，按说明书操作。总RNA经紫外分光光度计测定260 nm与280 nm处光密度比值（D260/D280）为1.9～2.1，琼脂糖凝胶电泳法检测总RNA纯度。采用PrimeScript逆转录试剂盒进行逆转录，采用SYBR实时荧光定量试剂盒进行实时定量PCR检测，反应在25 μl体系中进行，反应条件：50 ℃下30 min逆转录，94 ℃变性1 min，57 ℃退火1 min，72℃延伸7 min。以U6 snRNA作为内参，miR-132的相对表达量采用2-Ct计算。
2.5 miR-132转染及分组 将处于对数生长期的SaOS-2细胞按4×106个/孔接种到6孔板，每孔2 ml，细胞贴壁后分两组：①对照组：在培养基中加入浓度为50 nmol/L的Lipofectamine 2000；②转染组：在培养基中加入浓度为50 nmol/L 的CyTM3标记miRNA-132 mimic。培养24 h后收集细胞，在荧光显微镜下观察转染效率。
2.6 RT-qPCR检测miR-132转染后miR-132的表达 转染48 h后收集细胞，用Trizol试剂提取细胞总RNA并检测RNA的完整性和纯度，按照Hairpin-itTM miRNAs qPCR Quantitation Kit说明书进行操作，以U6 snRNA作为内参，miR-132的相对表达量采用2-Ct计算。
2.7 CCK-8法检测细胞增殖 将转染后培养24 h的SaOS-2细胞，制成单细胞悬液，以每孔4×103个细胞接种到96孔板，每孔200 μl，细胞贴壁后放置培养箱分别培养24、48、72和96 h，每组设5个复孔，同时设置空白调零组（不加细胞，加入等量的PBS）。培养结束前1 h，各孔加入CCK-8溶液0.01 ml后继续培养1 h，选择酶标仪波长为490 nm，测量吸光度值（A490）。
细胞存活率 =（实验组A490值-空白调零组A490值）/（对照组A490值-空白调零组A490值）×100%
2.8 荧光显微镜下观察细胞凋亡 将转染后培养24 h的SaOS-2细胞调整细胞浓度为1×105/ml，取1 ml细胞悬液接种于普通载玻片上，放置于6孔板上，待细胞过夜贴壁后，经甲醛固定后再加DAPI溶液染色5 min，置于荧光显微镜下观察。
2.9 Western blot检测蛋白表达 收集转染miR-132的SaOS-2细胞，裂解细胞并分离细胞蛋白质，用Bradford法测量蛋白浓度后取等量蛋白质样品（20 μg/孔），常规8% SDS-PAGE电泳，半干转膜仪转膜，5%脱脂奶粉封闭，加入特异性一抗（1：1000）于4 ℃下孵育过夜，HRP标记的羊抗兔IgG为第二抗体（1：2500）室温孵育1 h，ECL显色，条带暴光强度用Quantity One 4.6.2（BIO， RAD）软件分析，以β-actin为内参，通过与内参的灰度比，得出目的条带的相对表达水平。
2.1数据的统计学分析 用SPSS 17.0统计软件进行数据分析，计量资料均以均数±标准差（x±s）表示，正态分布变量两组间比较用t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。
3结果
3.1 miR-132 mRNA在骨肉瘤组织和癌旁正常组织中表达 实时荧光定量PCR结果表明，在34例骨肉瘤及对应的癌旁正常组织手术标本中，miR-132 mRNA的相对表达量分别为0.25±0.04和0.84±0.19，有显著性差异（P < 0.05）。
3.2各组SaOS-2细胞中miR-132 mRNA的表达 SaOS-2细胞经转染CyTM3标记的miRNA-132 mimic后，miRNA-132 mRNA的相对表达量为4.27±0.58，与对照组（0.68±0.16）相比较，差异有统计学意义（P
3.3 CCK-8法检测各组SaOS-2细胞增殖 如图1所示，CCK-8结果表明，自48 h起，转染组细胞存活率明显低于对照组，差异有统计学意义（P
图1 CCK-8法检测转染miR-132对SaOS-2细胞增殖的影响，
与对照组相比较，*P < 0.05。
3.4 流式细胞术检测SaOS-2细胞凋亡 细胞经DAPI染色后，荧光显微镜下观察到对照组SaOS-2细胞核完整，大小一致，而转染组细胞核出现明显固缩和凋亡小体等典型凋亡特征性改变（图2）。
对照组 转染组
图2 荧光显微镜下观察转染miR-132后对SaOS-2细胞凋亡的影响（×400）。
3.5 转染miR-132后对SaOS-2细胞中Mucin-4、HER-2和p-FAK蛋白表达的影响 如图3所示，Western blot检测结果表明，与对照组相比较，转染组SaOS-2细胞中Mucin-4、HER-2和p-FAK蛋白的表达明显下调，而FAK的表达无明显影响，差异均有统计学意义（P < 0.05）。
图3 Western blotting检测转染miR-132后对SaOS-2细胞中Mucin-4、
HER-2和p-FAK蛋白表达的影响，以β-actin为内参。
4讨论
微小RNA（microRNAs， miRNAs）是一类非编码小分子RNA，miRNAs可通过特异性识别靶基因mRNA的3’端非编码区位点而抑制蛋白翻译或诱导mRNA的降解，从而在转录后水平调控基因表达[1]。近年来研究表明miRNAs与恶性肿瘤的发生发展过程关系密切，其中miR-132 是目前比较公认的抑癌性miRNA，miR-132已经被发现在结肠癌和肺癌等多种恶性肿瘤中表达降低[2， 3]。miR-132主要是通过调控靶基因从而发挥抗肿瘤的作用，目前发现的几十种miR-132靶基因中，大多数已经被证实可直接调控肿瘤恶性生物学行为，例如PDCD4基因可抑制细胞增殖，ZEB2基因可抑制细胞侵袭和转移等[3， 4]。因此miRNAs有望成为恶性肿瘤诊断、治疗及预后评估中新的分子靶点，但miR-132对骨肉瘤生长和凋亡的作用及其作用机制尚未见报道。为此，本研究比较了miR-132 mRNA在34例骨肉瘤组织及癌旁正常组织标本中的表达差异，结果表明miR-132 mRNA在骨肉瘤组织中的表达明显降低，表明miR-132与骨肉瘤的发展过程关系密切。
癌症的发生是多基因和多因素共同参与的细胞增殖、分化以及凋亡异常的过程，而肿瘤细胞凋亡异常与恶性肿瘤的关系最为密切，在既往研究中，miR-132被证实能抑制恶性肿瘤生长，并诱导细胞凋亡[5， 6]，但目前尚未有miR-132对骨肉瘤细胞作用的研究报道。为进一步研究miR-132在骨肉瘤细胞生物行为中的作用，本研究通过转染miRNA-132至骨肉瘤saos-2细胞后，转染组细胞中miRNA-132 mRNA的表达显著上调，表明传染细胞miRNA-132成功。为了分析转染miRNA-132后对SaOS-2细胞增殖和凋亡的影响，CCK-8结果表明，转染miRNA-132后对SaOS-2细胞增殖有抑制作用，同时在荧光显微镜下也观察到转染miR-132后对体外SaOS-2细胞有凋亡诱导作用，表明miR-132在骨肉瘤细胞生长和凋亡中的重要作用。
研究发现Mucins家族蛋白在恶性肿瘤的发生发展以及逃避机体免疫监视等多种病理生理过程中发挥了重要的作用，从而表明其在恶性肿瘤的诊断中具有一定价值[7， 8]。Mucin-4作为Mucins家族中的重要成员，Mucin-4在正常组织细胞中呈低表达或无表达，但在肿瘤组织细胞中呈高表达状态[9]；同时Mucin-4与恶性肿瘤细胞对化疗药物耐药性关系密切[10]；另外膜蛋白HER-2/ErbB-2作为与Mucin-4共存蛋白，HER-2蛋白在稳定Mucin-4蛋白中起到关键作用，而HER-2蛋白在多种恶性肿瘤中已经被证实与肿瘤发生和发展过程密切相关[11， 12]。在本研究中，SaOS-2细胞经转染miRNA-132后，Mucin-4和HER-2蛋白的表达显著下调，同时转染miRNA-132后可有效抑制骨肉瘤细胞增殖，并诱导细胞凋亡，从而首次表明Mucin-4可能作为miRNA-132的靶蛋白，并在调控骨肉瘤细胞增殖和凋亡过程中发挥了一定的作用。另外，FAK作为HER-2的下游蛋白[13]，p-FAK与恶性肿瘤的发生发展、侵袭和转移等行为密切相关[14]，在本研究中，转染miRNA-132后可显著抑制p-FAK的表达，从而与Mucin-4和HER-2的表达结果相一致。
综上所述，本次实验结果表明转染miR-132后不仅可显著抑制体外骨肉瘤SaOS-2细胞生长，还能有效诱导体外骨肉瘤细胞凋亡，其作用机制可能为miR-132通过调控Mucin-4等凋亡相关蛋白的表达有关，从而为临床骨肉瘤基因治疗提供一个新的作用靶点，但仍需进一步深入研究miR-132抗癌效应的具体机制。
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