低位直肠癌淋巴结转移动物模型的建立及其E―钙黏蛋白的表达

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[摘要] 目的 建立裸鼠低位直肠癌淋巴结转移模型，检测E-钙黏蛋白在裸鼠低位直肠癌淋巴结转移模型中的表达，探讨其在直肠癌淋巴结转移过程中的作用。 方法 取对数生长期的人大肠癌细胞株SW480接种于裸鼠直肠黏膜下，建立裸鼠低位直肠癌淋巴结转移模型。按随机数字表法分为三组：直肠癌模型组（A组，40只，二甲基肼注射+SW480种植）、二甲基肼对照组（B组，40只，二甲基肼注射）和空白对照组（C组，40只，不作任何处理）。处死裸鼠，光镜下观察种植瘤组织和淋巴结转移情况，并采用免疫组化法检测种植瘤组织和转移淋巴结组织中E-钙黏蛋白表达水平。 结果 A组裸鼠约1周时成瘤率为100%，之后瘤结节逐渐长大。B组和C组裸鼠均未成瘤。A组裸鼠的肿瘤组织中E-钙黏蛋白阳性表达率（40.0%）明显低于肿瘤周边组织（82.5%），差异有统计学意义（χ2=7.24，P < 0.05）。B组裸鼠的直肠黏膜组织中E-钙黏蛋白阳性表达率为80.0%，C组裸鼠的直肠黏膜组织中E-钙黏蛋白阳性表达率为85.0%，A组肿瘤组织以及B组、C组三组比较差异有统计学意义（χ2=5.18，P < 0.05），A组的E-钙黏蛋白阳性表达率明显低于B组和C组（χ2=8.12、9.04，P < 0.05）。发生侧方淋巴结转移的A组裸鼠种植瘤组织中E-钙黏蛋白阳性表达率为33.3%，明显低于未发生侧方淋巴结转移的裸鼠种植瘤组织（100.0%），差异有统计学意义（χ2=10.28，P < 0.05）。 结论 二甲基肼预处理后进行人大肠癌细胞株SW480接种制模法成功构建了裸鼠低位直肠癌淋巴结转移模型。E-钙黏蛋白表达减弱可能在直肠癌发生、侵袭及淋巴结转移演进过程中起着重要作用。

[关键词] 直肠癌；淋巴结转移；E-钙黏蛋白；裸鼠

[中图分类号] R735.3 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2015）08（b）-0017-04

[Abstract] Objective To establish a nude mice low rectal cancer lymph node metastasis model and to detect the expression of E-calcium in low rectal cancer lymph node metastasis in nude mice model， to discusse its role in the process of rectal cancer lymph node metastasis. Methods To establish a nude mice model of low rectal cancer lymph node metastasis by using people's congress colon cancer cell line SW480. There were three groups according to random number table method： colorectal cancer model groups （group A， 40 cases， dimethyl hydrazine injection + SW480 planting）， dimethyl hydrazine in the control group （group B， 40 cases， dimethyl hydrazine injection） and blank control group （group C， 40 cases， do not make any processing）. After Executing nude mice， the growth of tumor tissue and lymph node metastasis were observed， and the expression levels of E-calcium protein in tumor tissues and metastasis lymph node tissues were detected using immunohistochemical method. Results The rate of nude mice tumor of group A was 100% about 1 week， after tumor nodules gradually grew up. Group B and group C had no tumor. The positive expression rate of E-calcium protein in tumor tissues of group A was 40.0%， was significantly lower than that in the tumor surrounding tissues of group A （82.5%）， the difference was statistically significant （χ2=7.24， P < 0.05）. The positive expression rate of E-calcium protein in rectal mucosa tissues of group B was 80.0% and the positive expression rate of E-calcium protein in rectal mucosa tissues of group C was 85.0%. Comparison between tumor tissues of group A and group B， group C， the difference was statistically significant （χ2=5.18， P < 0.05）， the positive expression rate of E-calcium in group A was lower than that in group B and group C， the differences were statistically significant （χ2=8.12， 9.04， P < 0.05）. The positive expression rate of E-calcium protein in tumor tissue of nude mice with lateral lymph node metastasis was 33.3%， was significantly lower than that in tumor tissue of nude mice without lateral lymph node metastasis （100.0%）， the difference was statistically significant （χ2=10.28， P < 0.05）. Conclusion The nude mice model for low rectal cancer lymph node metastasis is successfully build by dimethyl hydrazine pedestrians colorectal cancer cell line SW480 vaccination moulding method. The lower expression of E-calcium protein may play an important role in the process of occurrence， invasion and lymph node metastasis in colorectal cancer.

[Key words] Rectal cancer； Lymph node metastasis； E-calcium； Nude mice

直肠癌是最常见的消化道恶性肿瘤之一，在新疆少数民族中的发病率逐年升高。目前手术切除是治疗直肠癌的最有效的手段，而淋巴结转移是导致患者术后复发和死亡的重要原因，也是术后病情转归的重要观测指标[1]。影响直肠癌淋巴结转移的因素与多种蛋白分子相关，其中E-钙黏蛋白是直肠癌转移的重要因素，影响肿瘤生长速度、肿瘤大小、浸润深度及癌细胞远处转移[2]。本研究选用人大肠癌细胞株SW480建立低位直肠癌淋巴结转移模型，旨在探讨E-钙黏蛋白在直肠癌淋巴结转移过程中的作用机制。

1 对象与方法

1.1 对象

1.1.1实验动物及分组 BALB/Cnu/nu雄性裸鼠120只，SPF级，购自新疆医科大学动物实验研究中心（合格证号：SCHK2014-0007），鼠龄6～8周，体重18～22 g，分笼饲养于屏障系统的洁净层流架内，室温控制在（25±1）℃，相对湿度40%～50%。按随机数字表法将其分为三组：直肠癌模型组（A组，40只，二甲基肼注射+SW480种植）、二甲基肼对照组（B组，40只，二甲基肼注射）和空白对照组（C组，40只，不作任何处理）。

1.1.2细胞来源 人大肠癌细胞株SW480，由中科院上海细胞生物研究所提供，培养于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基，置37℃ 5%CO2培养箱内培养。

1.1.3 主要试剂 胎牛血清（FBS）购自杭州四季青生物工程材料有限公司，胰蛋白酶购自Sigma公司，RPMI-I64O培养基购自GiBco公司，鼠抗人E-钙黏蛋白单克隆抗体购自Dako公司，SP免疫组化试剂盒购自北京中山生物技术有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 人大肠癌细胞株SW480的培养 采用含10% FBS的RPMI-1640培养基培养，置37℃、5%CO2培养箱内培养，取生存状态良好的细胞，用0.25%胰酶消化后收集，以锥虫蓝检测细胞活性大于90%，加适量不含血清的RPMI-1640营养液配制成浓度为1×106个/mL的悬液备用。

1.2.2裸鼠低位直肠癌淋巴结转移模型的建立 将二甲基肼用生理盐水配成1%溶液，用4%NaOH溶液调成pH值为6.5～7.0，抽滤除菌，对A组和B组裸鼠的颈部皮下进行注射，30 mg/kg，1次/周，每周测体重1次，据体重调整剂量，至第8周末。B组裸鼠分笼饲养。A组裸鼠术前禁食12 h，采用10%水合氯醛（0.3 mL∶100 g）腹腔内注射，消毒会阴直肠腔，采用外翻直肠技术将直肠黏膜外翻显露于扩张的口外，取大肠癌细胞株SW480悬液0.2 mL缓慢注射接种于背侧缘上2 mm直肠黏膜下。术毕观察无活动性出血。术后所有裸鼠暂时分笼饲养直至完全清醒，再禁食禁水6 h后给予高能量饮食。C组不作任何处理。

1.2.3 制模后成瘤及浸润生长情况的观察 三组动物均以戊巴比妥（40 mg/kg）腹腔麻醉，分别于1、2、4、6周观测动物1次，通过颈部脱臼法处死裸鼠各10只，开腹观察成瘤及淋巴结转移情况。测量瘤块长度（a）和宽度（b），计算肿瘤体积（V）=ab2/2。切取A组裸鼠的肿瘤段组织及周围组织（包括侧方淋巴组织），切取B组和C组裸鼠的直肠及周围组织（包括侧方淋巴组织）。

1.2.4 苏木精-伊红（HE）染色 将切除的标本均浸于10%福尔马林中，常规石蜡包埋，连续切片，厚度4 μm，分别进行HE染色，光学显微镜下观察组织结构变化。

1.2.5 免疫组化检测E-钙黏蛋白表达水平 将切除的标本浸于10%福尔马林中，常规石蜡包埋，制作石蜡切片。石蜡切片常规脱蜡至水，热抗原修复。一抗孵育4℃过夜，磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗3次，二抗37℃孵育30 min，再次PBS冲洗3次。加新鲜配制的二氨基联苯胺（DAB）0.01 mol/L显色，PBS代替一抗作为阴性对照。

1.2.6 结果判读 利用BX41TF光学显微镜进行采图，以细胞膜及细胞浆内出现颗粒作为阳性细胞，每张切片随机选取5个高倍视野，每个视野计数100个肿瘤细胞，共计500个细胞，由3名病理医师独立计数。按阳性细胞所占百分比评分：阴性为0分，阳性细胞率延10%为1分，>10%～50%为2分，>50%～75%为3分，>75%为4分；按染色强度分3级：棕黄色为3分，黄色为2分，淡黄色为1分，无色为0分。阳性细胞数得分与染色强度得分相加≥5分为阳性（+），

1.3 统计学方法

采用SPSS 13.0统计学软件进行数据分析，计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 制模后成瘤及浸润生长情况

A组裸鼠经二甲基肼预处理后进行人大肠癌细胞株SW480接种制模，约1周时可见直肠壁内小结节形成，成瘤率100%，之后瘤结节逐渐长大，肿瘤体积测量结果见表1。6周时，6只裸鼠均发现瘤体浸润肠外，均可见侧方淋巴结转移浸润。B组和C组裸鼠均未成瘤。

2.2 种植瘤及侧方淋巴结的病理组织学检查

A组种植瘤组织镜下表现为低分化腺癌，癌细胞多呈圆形，椭圆形，核大，深染，异形，核分裂象多见；癌组织排列呈团状或索状，可见一些腺体结构存在，并浸润肠壁各层。见图1（封四）。A组裸鼠中发生转移的侧方淋巴结组织，镜下见转移灶癌组织与直肠种植瘤组织的形态结构十分相似。见图2（封四）。

2.3 三组裸鼠中E-钙黏蛋白表达检测结果

免疫组化检测三组裸鼠中E-钙黏蛋白表达情况，三组E-钙黏蛋白阳性表达率比较，差异有统计学意义（χ2=5.18，P < 0.05）。A组裸鼠的肿瘤组织E-钙黏蛋白阳性表达率明显低于肿瘤周边组织（χ2=7.24，P < 0.05）；A组肿瘤组织E-钙黏蛋白阳性表达率明显低于B组和C组，差异均有统计学意义（χ2=8.12、9.04，均P < 0.05）。见图3（封四）、表2。

接种6周时，A组裸鼠中有6例发现侧方淋巴结转移，与其余未发现转移的4例比较，发现侧方淋巴结转移的裸鼠种植瘤组织中E-钙黏蛋白阳性表达率明显低于未发现侧方淋巴结转移的裸鼠种植瘤组织，差异有统计学意义（χ2=10.28，P < 0.05）。

3 讨论

直肠癌是消化系统比较常见的恶性肿瘤，治疗失败的主要原因在于肿瘤的复发与转移，因此深入研究人直肠癌发病、转移浸润机制及抗转移治疗方法已经成为目前的主要任务之一，这就要求必须建立最能体现人体直肠癌特点的动物模型，为结肠癌转移机制和抗转移治疗的研究提供理想的动物模型[3]。以往研究较多的是人直肠癌皮下移植瘤动物模型，该模型建立容易、观察方便，但由于皮下移植瘤动物模型无法模拟人类直肠肿瘤发病的临床条件以及常见的一些恶性生物学特性，比如肝转移、淋巴结转移等，因此在肿瘤的治疗研究方面、特别是治疗机制研究方面的价值较小[4-7]。原位移植模型是将癌细胞悬液注射法和癌组织植块法通过手术种植在体内的相应部位，从而进行相应部位肿瘤研究的方法，其肿瘤的生物学特性与在体肿瘤较为一致[8-9]。目前国内研究人直肠癌的原位移植瘤模型较少，因此，为了进一步寻找理想的原位模型，本实验采用二甲基肼预处理裸鼠，进一步减低免疫性，将人结肠癌细胞株HCT-116细胞注射接种于裸鼠直肠黏膜下，从而模拟直肠癌临床发生、发展演变过程，旨在为大肠癌浸润转移机制和抗转移治疗提供稳定、理想的动物模型。

本实验采取不同时间取材着重观察了原位癌肿的生物学特性和转移规律发现：A组裸鼠经二甲基肼预处理后进行人大肠癌细胞株SW480接种制模，约1周时可见直肠壁内小结节形成，成瘤率为100%，之后瘤结节逐渐长大。在直肠黏膜植入肿块后，癌细胞局部形成肿瘤，随着接种时间延长，瘤体逐渐增大。继之6周时，6只裸鼠均发现瘤体浸润至肠外，均可见侧方淋巴结转移浸润。本实验显示，二甲基肼预处理后进行人大肠癌细胞株SW480接种制模法成功构建了裸鼠低位直肠癌淋巴结转移模型，客观地模拟了临床直肠癌患者体内增殖生长、侧方淋巴结转移的过程，操作简单，成瘤时间短，转移率高，制模稳定。这为进一步研究直肠癌转移机制、抗转移治疗提供了一种较理想的动物模型。

目前手术切除是治疗直肠癌最有效的手段，而淋巴结转移是导致患者术后复发和死亡的重要原因，也是术后病情转归的重要观测指标。直肠癌的淋巴结转移主要以上方为主，侧方淋巴结的转移是在上方通路阻塞的情况下才会发生，如果侧方淋巴结受浸，则表示疾病已属晚期。临床上发现行侧方淋巴结清扫的患者肿瘤复发及转移的时间隔长于淋巴结未清扫者。影响直肠癌淋巴结转移的因素与多种蛋白分子相关，其中肿瘤细胞获取高侵袭性的关键是E-钙黏附蛋白黏附功能丧失[10-11]。目前国际上并没有标准E钙黏蛋白与肿瘤转移相关性研究。本实验在成功建立裸鼠低位直肠癌淋巴结转移模型的基础上，通过免疫组织化学法检测了E钙黏蛋白在裸鼠种植瘤组织及相关邻近组织中的表达水平，初步评诂了侧方淋巴结转移的发生与E钙黏蛋白关系。研究结果发现，免疫组化检测三组裸鼠中E-钙黏蛋白表达情况，A组裸鼠的肿瘤组织中E-钙黏蛋白阳性表达率为40.0%（16/40），肿瘤周边组织中E-钙黏蛋白阳性表达率为82.5%（33/40），肿瘤组织中E-钙黏蛋白阳性表达率明显低于肿瘤周边组织（P < 0.05），且A组的E-钙黏蛋白阳性表达率也明显低于B组和C组（P < 0.05）。提示E-钙黏蛋白作为细胞之间的钙依赖性跨膜糖蛋白，在肿瘤的发生、生长过程中扮演着重要的角色，在直肠癌细胞的分化、增殖的环节中发挥着重要的生物学效应。

目前发现，E-钙黏蛋白表达的缺失是上皮-间质转化（EMT）过程中关键的一步，肿瘤细胞将其表型从上皮细胞转为间质细胞，从而获得侵袭性和游走迁移能力[12-13]。本组研究中也发现，接种6周时，A组裸鼠中有6例发现侧方淋巴结转移，与其余未发现转移的4例比较，发现侧方淋巴结转移的裸鼠种植瘤组织中E-钙黏蛋白阳性表达率为33.3%（2/6），明显低于未发现侧方淋巴结转移的裸鼠种植瘤组织中的E-钙黏蛋白阳性表达率（100.0%，4/4），差异有统计学意义（P < 0.05）。提示E-钙黏蛋白介导的黏附系统在肿瘤的浸润转移中可能起着重要作用。E-钙黏蛋白表达的减弱或缺失，导致肿瘤细胞间黏附性降低，诱导EMT发生，可促进肿瘤细胞获得侵袭和转移的能力，进而促进了肿瘤的浸润及淋巴结转移[14]，但其具体作用机制还不十分清楚，仍有待于进一步研究。

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（收稿日期：2015-02-13 本文编辑：任 念）