拟柱胞藻检测技术改进

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[摘要] 近年来，在我国各地陆续发现拟柱胞藻水华，由于其具有一定的毒性，而且发生水华时肉眼不易发现，同时爆发时，藻密度通常能达到每升上亿个细胞。该文根据与其它藻类不同的特性，提出了拟柱胞藻检测方法，通过对传统检测方法的改进，证明了其实用性、准确性和简洁性。

[关键词] 拟柱胞藻 检测 鉴定 改进

1 概述

拟柱胞藻(Cylindrospermopsis raciborskii)，又名拉氏拟柱胞藻，为蓝藻类原核生物念珠藻目念珠藻科柱胞藻属。由于其在不同的环境下，形态变化较大，因此，在我国有中华尖头藻和拉氏拟鱼腥藻等多个名称[1]。拟柱胞藻能够产生Cylindrospermopsin（CYN）、麻痹性贝毒、类毒素-A等。其中CYN能导致肝肾损害，也有可能致癌，麻痹性贝毒和类毒素-A均为神经毒素。据报道，在澳大利亚棕榈岛，有149人出现了肝肠炎症状，这与被拟柱孢藻所产生毒素污染的饮用水有较大相关性。拟柱孢藻在温带和热带地区的浅水水域（如湖泊、水库等）生长良好，一旦形成水华，数目巨大，如美国印第安纳州发现拟柱胞藻的19个湖泊中，藻密度均达到每升上亿个细胞[2]。近年来，在我国山东、湖北、广东和云南等地陆续发现了拟柱胞藻及其水华。

由于拟柱胞藻通常不在水体表面形成明显的浮膜，根据近几年对莆田市东圳水库拉氏拟柱胞藻的上百次日常检定发现，若待到发现水体颜色变为较为明显的黄绿色，则藻密度至少在2×108个细胞/升以上。一旦水华爆发，其藻类数量将占藻类总数的98%以上。因此，拟柱胞藻的检测方法，在对水库、湖泊水质的预警和水质评价中具有十分重要的意义。

2 拟柱胞藻检测现状

由于拟柱胞藻是发现能产生毒素的最新蓝藻种类，在国内各项标准中均未见对拟柱胞藻的毒素或藻密度做出相关规定。在我国，福建、山东、湖北和云南等地发现了拟柱胞藻及其水华。本文在深入理解《水和废水监测分析方法》（第四版增补版）中关于藻类检测方法的基础上进行了技术试验，总结出鉴定拟柱胞藻并改进的快速检测方法[3]。下面主要以莆田市东圳水库的拟柱胞藻检测为例进行说明。

3 拟柱胞藻检测方法及改进介绍

3.1 仪器及试剂

奥林巴斯AX31显微镜，设备包括带指示方框的10×目镜，10×、20×、40×物镜；

有机玻璃采水器；

分液漏斗；

0.1mL微量移液器；

50mL棕色标本瓶；

计数框：面积为20×20mm、容量为0.1mL，其内划分横直各10行格，共100个小方格。

22mm×22mm盖玻片；

鲁哥氏液（Lugols solution）：称取4g碘及6g碘化钾，溶于100mL纯水中，避光保存。

福尔马林固定液：将4mL福尔马林（40%）甲醛和10mL甘油溶于86mL纯水中。

3.2 水样的采集及固定

用有机玻璃采水器采集100～2000mL水样（视水中藻密度大小适当增减采水量），采样后及时加入1%体积的鲁哥氏液固定。如需长期保存，再加入几毫升福尔马林固定液，密封保存。

3.3 沉淀和浓缩

由于拟柱胞藻细胞个体小，且一旦形成水华，数目巨大，故根据藻密度，对固定后的水样进行不同的处理。

当藻密度较低，即每升浓度低于10万个细胞时，将水样充分摇匀后，取1000mL在分液漏斗中沉淀，沉淀时间须满48小时。在计数时，取沉淀物约30毫升，定容至50毫升。

当拟柱胞藻每升浓度处于10万～30万个细胞时，无需沉淀和浓缩，可直接进行鉴定。

当藻密度大于每升30万个细胞时，根据实际需要进行稀释，并补充适量的鲁哥氏液进行染色固定。

3.4 拟柱胞藻的鉴定和计数

由于拟柱胞藻藻丝不易断裂，将计数样品充分摇匀后，迅速吸取0.1mL样品到计数框中，盖上盖玻片。计数框中应无气泡，也无样品溢出。标本制成后，静置几分钟，使藻体沉至框底，再进行镜检。

3.5 拟柱胞藻的鉴定

拟柱胞藻整条藻丝粗细均匀，藻丝通常宽2～3微米，长度变化较大，从10～120微米的都有。形态上，大部分为直线形，在某些地区会发现有卷曲形的[2]，有时可见异形胞。在其生长旺盛期，可见丰富的气泡。拟柱胞藻的单个细胞长度范围为3～10微米，由于其很少出现细胞收缩，故单个细胞往往很难区分。

图1 直线型拟柱胞藻

图2 卷曲形拟柱胞藻

图3 直线型拟柱胞藻的异形胞

3.6 拟柱胞藻的计数

在东圳水库，拟柱胞藻爆发期的藻密度通常在每升两亿个细胞以上，为了减少工作量，对传统的计数方法进行了改进。

首先，根据拟柱胞藻的个体长度与细胞特性，计数时，显微镜目镜使用10倍，物镜使用20倍，依照目镜行格法，间隔选取四个“半行格”（见图4），先对藻丝的个体数进行统计。一个“半行格”内的个体数目一般不少于100个。图4所示方法有以下三个好处：第一，在10×20倍放大倍数下，每个视野的直径刚好等于1mm，即等于面积为20×20mm划分成100方格后，每个方格边长的一半，单次横向的十格次视野，刚好是1/2行格，较之10×20倍放大倍数，一次横向检测所计视野面积大了一倍，大大减少了工作量，加快检测速度；第二，拟柱胞藻的藻丝长度在该放大倍数下，较为清楚，同时，由于拟柱胞藻含有丰富的伪空泡，沉淀时间不足的情况下，藻丝常会悬浮在水中，常常出现分层现象，故需要在镜检计数过程中，需要不断调整焦距，比起使用10×40倍的放大倍数，减小了调整幅度，使计数更为轻松快捷，减缓视力疲劳；第三，取不同行格的上下位置计数，能够较为均衡准确地统计总数，使统计结果更具代表性和准确性。

统计完个体数后，转换使用40倍物镜，随机选取若干个不重复视野，统计各视野内全部藻丝个体的细胞数和个体数，再进行换算。一般所参与此处统计的个体数不得少于30条。