丹皮酚通过抑制PI3K/AKTNF拨B通路对LPS诱导的与平滑肌细胞共培养的大鼠血管内皮细胞的保护作用

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[摘要] 该研究为观察丹皮酚（Pae）对脂多糖（LPS）诱导的与平滑肌细胞（SMC）共培养内皮细胞（VEC）的保护作用以及对磷脂酰肌醇3激酶（phosphoinositide3kinase， PI3K）/丝/苏氨酸激酶（serine threonine kinase， AKT）/核因子κB（nucler factorkappa B， NFκB）信号通路的影响。采用组织块预消化贴壁法原代培养大鼠血管内皮细胞和大鼠血管平滑肌细胞；用Transwell小室建立VECSMC共培养模型； LPS（100 μg・L-1，7 h）诱导VEC损伤；MTT法检测VEC活性；LDH试剂盒检测细胞通透性；Western blot法检测Pae（15，30，60 μmol・L-1，24 h）对LPS诱导损伤的共培养VEC的PI3K/AKT及NFκB信号通路的表达；Western blot法检测VEC的细胞核pP65表达的影响。研究证实不同浓度的Pae可显著性抑制LPS诱导的VEC损伤，提高细胞活性；并且Pae能够明显下调LPS诱导的PI3K，pPI3K，AKT，pAKT的表达；下调NFκB的表达水平并降低P65蛋白的生物活性，下调pP65蛋白的表达；下调P65的转移入核。Pae对LPS损伤的VEC有保护作用，可能通过抑制pi3k/AKT及NFκB信号通路相关信号蛋白的表达。

[关键词] 丹皮酚； 血管内皮细胞； 血管平滑肌细胞； 共培养； PI3K/AKT信号通路； NFκB信号通路

Paeonol affects proliferation activity of rat vasular endothelial cells induced

by lipopolysaccharide and cocultured with smooth muscle cells via

inhibiting pathway of PI3K/aktnfκB signaling

HU Wenjun， ZHANG Zhen， DAI Min*

（College of Pharmacy， Anhui University of Chinese Medicine， Key Laboratory of Xin′an Medicine， Ministry of Education， Hefei 230038， China）

[Abstract] This paper was aimed to observe the antiatheroslerosis effect of paeonol （Pae） on the activation of PI3K/AKTNFκB and the proliferation activity of rat vasular endothelial cells induced by lipopolysaccharide （LPS） and cocultured with smooth muscle cells Primary rat vascular endothelial cells （VECs） and rat vascular smooth cells （VSMCs） were cultured by predigesting and adhering tissue blocks The VECVSMC coculture model was established by Transwell chamber LPS （100 μg・L-1， 7 h） was used to induce VEC injury MTT assay were used to determine the VEC proliferation activity Western blot was used to detect PI3K/AKT and NFκB′s signaling pathways related protein expressions The concentration of LPSinduced VECs injury was 100 μg・L-1， and the time was 7 h After the intervention on the above cell model for 24 h， paeonol （15， 30， 60 μmol・L-1） could effectively inhibit LPSinduced VECs injury， block PI3K/AKTNFκB signal transduction pathway thereby significantly affecting the proliferation of LPSinduced VECs cocultured with SMCs The antiatherosclerosis mechanism of paeonol may be related to the reducing the inhibitory effect of the signaling pathway associated proteins of VEC PI3K/AKT and NFκB， thereby increasing the VEC livability under coculture

[Key words] paeonol； endothelial cells； smooth muscle cells； coculture； PI3K/AKT signaling pathway； NFkappa B signaling pathway

doi：10.4268/cjcmm20161221

动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）的发生发展过程始终伴随炎症反应，其中，血管内皮细胞（vascular endothelial cells， VEC）的慢性炎症损伤是AS发生的先决条件及发病的重要机制[1]。VEC受到致炎因子[如脂多糖（LPS）]损伤后，其黏附、分泌、增殖功能可能发生改变，分泌多种炎性因子及生长因子，并引起平滑肌细胞（smooth muscle cell， SMC）的增殖与迁移；SMC分泌各种黏附分子，会作用到受损的内皮细胞上，使内皮细胞黏附功能增强，与单核细胞的黏附增加，AS的斑块形成加速。丹皮酚（paeonal， Pae）是毛茛科植物牡丹Paeonia suffruticoas Andr的干燥根皮及萝摩科植物徐长卿Cynanchum paniculatum（Bge）Kitag的干燥根及根茎中的有效成分之一，具有解热、镇痛、抗炎、抗动脉粥样硬化、抗氧化、抗血栓、抗肿瘤等广泛的药理作用[2]。本课题组前期通过建立VECSMC共培养体系，观察在共培养条件下VEC的损伤对于SMC的增殖、迁移的影响以及Pae的作用。本实验探索共培养条件下SMC的存在对于VEC的功能的影响，阐明Pae是否是通过影响PI3K/AKTNFκB信号通路发挥对VEC的保护作用。

1 材料

11 试剂与仪器

Pae（安徽宣城百草植物工贸有限公司，批号20141205，纯度99%）；lps（美国Sigma公司），第Ⅷ因子抗原，αSMA（武汉博士德生物工程有限公司）；BCA蛋白定量试剂盒（上海浩然生物技术有限公司）；βactin小鼠单克隆抗体，PI3K抗体，pPI3K抗体，AKT抗体，pAKT抗体，pP65抗体，IκB抗体，pIκB抗体（美国Bioworld 公司）；辣根酶标记山羊抗鼠IgG，辣根酶标记山羊抗兔IgG（中杉金桥）；Protein Ladder（美国Thermo公司）；PI3K 特异性抑制剂LY294002，NFκB 抑制剂PDTC（碧云天生物技术研究所）；多功能酶标仪（美国MD公司）；CK2型倒置显微镜（日本Olympus公司）；Hoefer电泳仪（Amersham Biosciences公司）；凝胶成像系统（美国BioRad公司）。

12 动物

清洁级雄性SpragueDawley（SD）大鼠，体重（180±10） g，安徽医科大学动物实验中心提供，生产许可证号SCXK（皖）20110015。

2 方法

21 大鼠主动脉VEC分离、培养与鉴定

211 鼠尾胶原的制备及培养瓶的包被[3] 经颈椎脱臼处死大鼠，剪下全尾于75%乙醇浸泡30 min，于无菌条件下剥离尾腱，置于培养皿中，灭菌超纯水清洗3次，尽可能地剪碎尾腱，放入100 mL 01%乙酸溶液中，置4 ℃冰箱中摇晃48 h。后移入灭菌离心管中，4 000 r・min-1离心30 min，吸取无色透明胶状上清液，分装，-20 ℃冷冻保存。

212 VEC的分离、培养与鉴定[2] 大鼠经颈椎脱臼处死，无菌环境下取出胸主动脉，剥离血管外脂肪以及结缔组织，外翻血管，暴露内膜，灭菌线将血管两端处扎紧后用培养液冲洗内膜。将血管放入装有02%Ⅰ型胶原酶的小瓶中，放入37 ℃，5% CO2培养箱消化30 min，用含20% FBS的培养液漂洗2次，用刀片将血管两末端切去，将剩下的主动脉血管剪成2 mm×2 mm小块，内膜朝下贴入鼠尾胶原包被的培养瓶中，加入1 mL含20% FBS的培养液，置37 ℃，5 % CO2培养箱培养一段时间[4]。当原代细胞爬出并形成致密单层细胞时即可传代。采用免疫细胞化学SP法鉴定血管内皮细胞。

22 大鼠主动脉SMC的分离、培养与鉴定

取大鼠脱颈椎处死，在无菌条件下，迅速取出主动脉，用眼科剪沿血管外侧纵向剖开，内膜面向上，用刀片自上而下刮1～2遍，除内皮细胞，然后用钟表镊细心、迅速只撕下中膜内、中层1 mm以内的小条，浸泡在20%胎牛血清的DMEM培养液内，用刀片切成约1 mm3后，放入015%胶原酶内消化6 h后1 000 r・min-1离心7 min。取新鲜配制的20%胎牛血清的DMEM液5 mL加入离心管内离心漂洗。将离心管内的组织块转移至培养瓶内，置于37 ℃，5% CO2培养箱中培养。采用免疫细胞化学SP法鉴定血管内皮细胞胞浆内αSMA的表达。

23 Transwell共培养体系的建立[5]

取传至3～5代VEC和SMC，胰酶消化制成细胞悬液，调整VEC，SMC至1×105个/mL，将SMC细胞悬液以每孔2 mL的量接种于6孔培养板的底部，Transwell内膜朝上放于无菌培养皿内，将VEC细胞悬液以每孔1 mL的量接种于Transwell 内膜上，插入底部接种过SMC的6孔培养板中，建立Transwell共培养体系。

24 分组

将建立好的共培养体系分为A，B，C，D，E 5组，每组3孔。A组为VECSMC共培养空白对照组，B组为LPS（100 μg・L-1 LPS）模型组，C组为丹皮酚高剂量组（100 μg・L-1 LPS +60 μmol・L-1丹皮酚），D组为丹皮酚中剂量组（100 μg・L-1 LPS +30 μmol・L-1丹皮酚），E组为丹皮酚低剂量组（100 μg・L-1 LPS +15 μmol・L-1丹皮酚）。C，D，E组中的丹皮酚应预先加入，24 h后再向各组中加入 LPS，在37 ℃，5% CO2孵箱中孵育7 h立即进行后续检测。

25 VEC活力检测

251 MTT法检测VEC的活性 将VEC细胞悬液（1×105个/mL）接种于6孔细胞共培养体系上室中，SMC细胞悬液（1×105个/mL）接种于共培养体系下室，按上述分组进行处理，培养相应时间。按照MTT法进行，酶标仪490 nm测定吸光度（A）。

252 比色法检测LDH漏出量 将VEC细胞悬液（1×105个/mL）接种于24孔细胞培养板中，给予含不同浓度Pae（75，15，30，60，120 μmol・L-1）培养液1 mL/孔，培养24 h。吸弃培养液，PBS轻洗1次，加入含LPS（100 μg・L-1）细胞培养液1 mL/孔继续培养7 h。按照LDH检测试剂盒说明书进行操作，在多功能酶标仪440 nm测定A。

26 Western blot法检测PI3K，pPI3K，AKT，pAKT，IκB，pIκB，pP65的表达

将VEC细胞悬液（1×105个/mL）接种于6孔细胞共培养体系上室中，VSMC细胞悬液（1×105个/mL）接种于共培养体系下室，在上述分组基础上增加PI3K抑制剂LY294002，NFκB 抑制剂PDTC组，处理后用PBS清洗3次，加入蛋白抽提试剂，取上清，用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。制备10% SDS聚丙烯酰胺凝胶分离胶，电泳分离蛋白后转移至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭4 h，加入相应抗体4 ℃孵育过夜，PBST洗膜后加入二抗IgGHRP，室温摇床2 h，ECL发光，显影，冲洗胶片后扫描至计算机中，用ImageJ图像分析软件进行分析处理。

27 统计学处理

采用SPSS 170软件进行单因素方差分析，各组间数据比较采用t检验，进行显著性分析，实验数据均以±s表示。P

3 结果

31 VEC及SMC形态学观察及鉴定

倒置相差显微镜下观察：原代培养的VEC呈多角形状单层铺路石样紧密的排列着，细胞核清晰可见，边缘光滑。用SP免疫细胞化学法检查第Ⅷ因子相关抗原表达，倒置显微镜下呈阳性反应，胞浆呈棕黄色（图1A）。SMC呈长梭形状，多层峰谷状排列，用SP免疫细胞化学法检查平滑肌肌动蛋白αSMA表达，SMC胞浆棕黄色，即阳性反应（图1B），证明所培养细胞分别为VEC和SMC。

32 Pae对LPS诱导的共培养条件下VEC活性的影响

共培养条件下，与空白组比较，LPS刺激后VEC活性显著性降低；不同浓度Pae（30，60 μmol・L-1）预处理VEC一段时间后VEC活性明显增强（P

33 Pae对LPS诱导VEC释放LDH的影响

LPS组LDH释放量明显增多（P

34 Pae对LPS诱导的共培养VEC的PI3K/AKT信号通路的表达的影响

LPS刺激后细胞PI3K磷酸化水平的表达明显与空白对照组相比##P

35 Pae对LPS诱导损伤的共培养VEC的NFκB信号通路的表达的影响

LPS显著上调共培养条件下VEC中IκB，pIκB蛋白表达水平（P

36 Pae对LPS诱导的共培养VEC的细胞核内pP65表达的影响

pP65蛋白的转移进入细胞核是NFκB信号通路激活的关键步骤，共培养条件下VEC在LPS刺激后，细胞核内pP65蛋白表达水平明显高于空白组VEC（P

4 讨论

VECSMC共培养体系最大程度模拟体内环境、维持体内性状，观察细胞与细胞之间相互作用，对于疾病分子机制的研究和新药的研发具有重要意义[6]。避免了单层细胞培养因体外环境的改变，逐渐丧失原有的生物学特性，致使研究结果和体内的情况不相符。在共培养条件下，VEC除形态发生改变外，多种与血管新生有关的基因表达也随之改变[78]。本文研究共培养条件下SMC对VEC的影响，在Transwell膜下室种植SMC，上室种植VEC，细胞生长良好，使得细胞中的相互作用能顺利进行。

LPS作为AS感染的主要诱因，强烈的炎症启动因子，可通过与VEC上的LPS受体结合，使溶酶体受损，酶外泻，胞浆发生空泡变性，浆膜皱缩，引起VEC的直接损伤[9]。本研究结果LPS（100 μg・L-1）作用VEC 7 h可以明显降低细胞活性，LDH释放明显增多，提示LPS可以损伤VEC，导致细胞通透性改变。而预先给予含不同浓度Pae（15，30，60 μmol・L-1）的培养液孵育24 h后，可以显著提升VEC的活性，降低细胞膜的通透性，保护LPS所致的VEC的损伤。

PI3K/AKT和NFκB信号功能蛋白广泛参与LPS诱导的VEC损伤。PI3K介导细胞炎症性反应的调节过程[10]；LPS能够促进细胞炎症性因子的释放，增强PI3K的生物学活性，促使AKT蛋白的活化调节细胞功能；活化的NFκB迁移至核内，在核内NFκB核转录因子可诱导众多炎症相关的特异基因如TNF，IL6等的表达。笔者进一步研究发现LPS作为刺激因子作用后，VECSMC体系下的VEC损伤严重的同时，PI3K/AKTNFκB信号通路激活，关键的信号分子PI3K，pPI3K，AKT，pAKT以及细胞核pP65表达显著上调，而Pae能够通过降低PI3K，AKT的磷酸化和较少P65的入核，从而抑制其下游信号通路。因此笔者推测，Pae可能是通过下调LPS诱导的VEC PI3K/AKT及NFκB信号通路相关信号蛋白的表达从而发挥保护VEC的作用，是其抗AS作用的部分机制。

[参考文献]

[1] Ross R Atheroselerosis：an inflammatory disease[J] N Engl J Med， 1999， 340（2）： 115

[2] 张振， 戴敏 丹皮酚对脂多糖诱导损伤的与平滑肌细胞共培养的大鼠血管内皮细胞黏附功能的影响[J] 中国中药杂志， 2014， 39（5）： 63

[3] Quehenberger O Thematic review series： the immune system and atherogenesis Molecular mechanisms regulating monocyte recruitment in atherosclerosis[J] J Lipid Res， 2005， 46（8）： 1582

[4] Raman K， Chong M， AkhtarDanesh G G， et al Genetic markers of inflammation and their role in cardiovascular disease[J] Can J Cardiol， 2013， 29（1）： 67

[5] LesseyMorillon E C， Osborne L D， MonaghanBen son E， et al The RhoA guanine nucleotide exchange factor， LARG， mediates ICAM1dependent mechanotransduction in endothelial cells to stimulate transendothelial migration[J] J Immunol， 2014， 192（7）： 3390

[6] 李玉洁， 杨庆， 翁小刚， 等 血管内皮细胞平滑肌细胞共培养体系研究进展[J] 中国中药杂志， 2012， 37（3）： 265

[7] Ley K， Laudanna C， Cybulsky M I， et al Getting to the site of inflammation： the leukocyte adhesion cascade updated[J]Nat Rev Immunol， 2007， 7（9）： 678

[8] Tanaka T， Umemoto E， Miyasaka M Lymphocyte trafficking and immune surveillance[J] Jpn J Clin Immunol， 2006， 29（6）： 359

[9] MiziaStec K Cytokines and adhesive molecules in detection of endothelial dysfunction[J]Pharmacol Rep， 2006， 58（Suppl）： 21

[10] 孙佳， 夏海鸣 脂多糖相关受体及其介导的信号转导通路[J] 医学综述， 2010， 16（3）： 324