中药启膈散免疫调节作用的体外实验研究

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[摘要] 目的：探讨启膈散抗肿瘤作用的机制，为启膈散治疗肿瘤提供客观依据。方法：将实验细胞分为启膈散组、刀豆蛋白A（concanavalin A，ConA）组、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）组和空白对照组，ConA组及LPS组分别给予ConA、LPS 5 μg/ml，空白对照组不给药，采用MTT法观察50.00、25.00、12.50、6.25、3.13、1.63、0.78 mg/ml启膈散水提取物对小鼠脾细胞体外增殖的促进作用，50.00、5.00、0.50 mg/ml时对小鼠脾细胞分泌IL-2的影响；50.00、5.00、0.50 mg/ml时对小鼠单核细胞分泌TNF-α的影响；50.00、5.00、0.50 mg/ml时对NK细胞肿瘤细胞杀伤活性的影响。结果：启膈散显著刺激小鼠脾细胞增殖，且存在明显的量效关系；能显著提高小鼠脾细胞分泌IL-2的活性；促进小鼠单核细胞分泌TNF-α作用显著；可提高NK细胞对靶细胞的杀伤率。结论：启膈散的抗肿瘤活性可能与其免疫调节功能有关。

[关键词] 启膈散；肿瘤；免疫；IL-2；TNF-α；NK

[中图分类号] R285.5[文献标识码]A [文章编号]1673-7210（2009）06（c）-017-03

In vitro experiment of TCM Qige Powder on immune regulation

LI Jijun1, ZHOU Jichun2, ZHANG Shengjun3, WANG Qijun3

(1.Central Hospital of Cangzhou City, Cangzhou 061001, China; 2.College of Chinese Medicine, Hebei Medical University, Shijiazhuang 050091, China; 3.Postgraduate College of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050091, China)

[Abstract] Objective: To explore the anti-tumor mechanism of Qige Powder, and provide objective basis for treating tumor by Qige Powder. Methods: The experimental cells were divided into Qige Powder group, concanavalin A (ConA) group, lipopolysaccharide (LPS) group and control group, ConA group and LPS group were given 5 μg/ml ConA and LPS respectively, the control group was not given drug. The promoting effect of Qige Powder water extract with doses of 50.00, 25.00, 12.50, 6.25, 3.13, 1.63 and 0.78 mg/ml on in vitro mice spleen cells was detected with MTT assay; the effect of Qige Powder water extract with doses of 50.00, 5.00 and 0.50 mg/ml on IL-2 secreted by mice spleen cells, the effect of Qige Powder water extract with doses of 50.00, 5.00 and 0.50 mg/ml on TNF-α secreted by mice monocytes and the cytotoxic activity of Qige Powder water extract with doses of 50.00, 5.00 and 0.50 mg/ml on tumor cells caused by NK cells were observed respectively. Results: Qige Powder could significantly promote the increase of mice spleen cells, and it should an obvious dose-dependent relationship; it could also improve the IL-2 level secreted by mice spleen cells and the secretion of TNF-α by mice monocytes, and enhanced the killing rate of NK cells to target cells. Conclusion: The anti-tumor activity of Qige Powder is probably associated with its immune regulation.

[Key words] Qige Powder; Tumor; Immune; IL-2; TNF-α; NK

本实验以古方启膈散化裁，治疗食管癌、贲门癌、胃癌等术后患者及晚期不宜行手术或放、化疗患者，发现有较好的疗效，将其推广应用于其他恶性肿瘤，也取得了比较满意的效果。通过大量病例证实，启膈散不仅能缩小、除肿瘤，还能改善患者的临床症状，提高其生活水平，使其可带瘤长期生存[1]。本实验分析，启膈散的抗肿瘤机制可能是通过提高免疫功能实现的，因此设计了若干体外免疫实验，以探讨启膈散的抗肿瘤作用机制，并试图为发掘、研究古方提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 肿瘤细胞株

小鼠成纤维细胞瘤细胞株L929、小鼠淋巴瘤细胞株Yac-1、小鼠IL-2依赖细胞株CTLL-2由河北医科大学第四医院科研中心提供。

1.2 试剂

中药启膈散（沙参、郁金、丹参、川贝、荷叶、茯苓、砂仁、浮小麦代杵头糠）由河北医科大学第四医院中药房提供，加水浸泡煎2次，第1次加水12倍量，第2次加水8倍量，浓缩至每毫升含0.5 g生药的药汁，0.22 μm孔径滤膜过滤，-20℃避光保存；实验前检测最高及最低浓度的渗透压，并调节pH，使其对细胞生长无影响。刀豆蛋白A（concanavalin A，ConA）、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）均为SIGMA公司产品。MTT、ConA组及LPS组药品分别由华美生物工程公司提供（批号BSO887）。

1.3分组

实验细胞分为启膈散组、ConA组、LPS组和空白对照组。

1.4 实验仪器

CO2培养箱：美国SHELDON公司产品（型号TC2323）；低温高速离心机：日本HITACHI产品（型号SCR20B）。

1.5 实验动物

BALB/C小鼠，雌性，6～8周龄，体重18～22 g，由河北医科大学动物中心提供。

1.6 方法

1.6.1 启膈散对小鼠脾细胞增殖作用的影响[2-3]小鼠脾淋巴细胞以1×107个/ml浓度接种于96孔培养板，分别加入ConA、LPS（终浓度为5 μg/ml）和启膈散提取液，培养72 h。加入MTT，继续培养4 h后，弃上清，加入DMSO，振荡15 min。检测OD492nm，并计算细胞增殖率。

1.6.2 启膈散对小鼠脾T细胞分泌IL-2生物活性的影响[4-5] 小鼠脾淋巴细胞接种于直径为6 cm的培养皿。培养2 h，收集未贴壁细胞，以1×107个/ml浓度接种于96孔培养板，分别加入ConA（终浓度为5 μg/ml）及中药提取液。培养24 h，收集培养上清，0.22 μm孔径滤膜过滤，备用。CTLL-2细胞配成5×105个/ml的细胞悬液，接种于96孔板，每孔50 μl。取50 μl待测上清分别加入各孔，培养40 h后加入MTT，继续培养4 h，弃上清，各孔加入DMSO，振荡15 min，测OD492nm。

1.6.3启膈散促进小鼠单核细胞分泌TNF-α的检测[6-7]小鼠脾细胞悬液接种于直径为6 cm的培养皿，培养2 h，收集贴壁细胞，以5×106个/ml浓度接种于96孔培养板，分别加入LPS（终浓度为5 μg/ml）及中药提取液。培养24 h，收集培养上清，0.22 μm孔径滤膜过滤，备用。2×105个/ml浓度的L929细胞接种于96孔培养板，培养24 h，弃上清，每孔加放线菌素D（4 μg/ml）50 μl，按上法收集上清50 μl，培养24 h，加结晶紫100 μl，孵育15 min，SDS显色，酶标仪测OD492nm。

1.6.4 启膈散对小鼠脾NK细胞杀伤作用的影响[8-9]1×107个/ml小鼠脾细胞悬液接种于96孔培养板，每孔100 μl，分别加入ConA（终浓度为5 μg/ml）和启膈散提取液10 μl，培养24 h。收集培养上清，0.22 μm孔径滤膜过滤，备用。小鼠脾细胞接种于直径为6 cm的培养皿，培养2 h，收集未贴壁细胞，调整细胞浓度至1×107个/ml，备用。取对数生长期小鼠淋巴瘤细胞株Yac-1，调整细胞浓度为2×105个/ml，备用。阴性对照组每孔加100 μl效应细胞或靶细胞，再加入100 μl 1640培养基。阳性对照组和实验组每孔加入100 μl效应细胞，再加入100 μl靶细胞，效应细胞/靶细胞（E/T）比例为50∶1，制备上清10 μl，培养24 h。每孔加入MTT，继续培养4 h后，弃上清，加入DMSO。检测OD492nm，计算抑制率。

1.7 统计学方法

数据以均数±标准差（x±s）表示，所有数据经SPSS 10.0统计软件包处理，各组的组间均数比较用单因素方差分析，实验组与对照组组间均数比较用独立样本t检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 启膈散对小鼠脾细胞增殖的影响

启膈散（1.63~50.00 mg/ml）表现出较强的促小鼠脾细胞增殖作用，其作用明显优于ConA及LPS（P

图1 启膈散对体外小鼠脾细胞增殖的影响

2.2 启膈散对小鼠脾T细胞分泌IL-2的影响

不同浓度的启膈散提取物均能刺激小鼠脾细胞分泌IL-2，与未加药液的空白对照组相比，有显著性差异。50.00 mg/ml启膈散能显著提高小鼠脾T细胞分泌IL-2的活性，作用强于ConA组（P

图2 启膈散对小鼠脾T细胞分泌IL-2的影响

2.3 启膈散对小鼠单核细胞分泌TNF-α的检测

50.00 mg/ml启膈散促进小鼠单核细胞分泌TNF-α的作用显著优于其他实验组和空白对照组（P

图3 启膈散对小鼠单核细胞分泌TNF-α的影响

2.4 启膈散对小鼠脾NK细胞增殖的影响

启膈散3个剂量刺激小鼠脾NK细胞对靶细胞的杀伤率均大于空白对照组（P

3 讨论

启膈散来源于《医学心悟》噎膈篇，融扶正邪于一炉。方中沙参养生津，清胃中之邪热而不滋腻为君，川贝润燥化痰，郁金、丹参活血散瘀、行气散结为臣，茯苓健脾补中、渗利水湿，砂仁、荷叶蒂醒脾和胃、散结导滞、行气下气为佐，浮小麦益气清热为使。全方有养阴利气、化痰解瘀之功效，自古是治疗肿瘤的有效方剂。

本研究发现，启膈散明显促进小鼠脾细胞增殖，其增殖作用呈浓度依赖性，证实不同浓度的启膈散提取物均能不同程度地刺激小鼠脾细胞分泌IL-2。启膈散能明显刺激单核细胞分泌细胞因子TNF-α，且诱生的TNF-α对肿瘤细胞具有杀伤活性。实验结果提示，启膈散可以刺激免疫细胞分泌细胞因子，且分泌的细胞因子具有抗肿瘤活性。启膈散被稀释10倍后，其杀伤率有所降低，稀释100倍时杀伤率仍高于正常，说明启膈散作为TNF-α的诱导剂诱导作用显著，且诱导的TNF-α活性水平高。本实验以小鼠脾细胞为效应细胞，Yac-1细胞为靶细胞，用MTT法检测小鼠脾细胞的NK活性，结果提示，启膈散与小鼠脾细胞共同孵育后的培养上清能够增强NK细胞杀伤靶细胞的能力。由此可以推断，启膈散对正常免疫细胞的增殖作用是通过刺激免疫细胞分泌的细胞因子而发挥作用的。NK细胞实验结果证实了上述推测，启膈散刺激免疫细胞分泌的细胞因子不仅可以促进正常免疫细胞的增殖，而且具有激活NK细胞、提高NK细胞杀伤肿瘤的能力，也从另一个方面证明启膈散对特异性免疫及非特异性免疫均有促进作用。

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（收稿日期：2008-12-25）