蝴蝶兰外植体诱导分化与培养基筛选技术研究

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摘要 以蝴蝶兰的花梗为外植体，采用不同的培养基进行诱导分化、增殖生根试验。结果表明：蝴蝶兰诱导培养基MS+6-BA 3.0 mg/L+花宝1号1.0 g/L+柠檬酸30 mg/L、分化培养基MS+6-BA 5.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L+椰子汁10%+柠檬酸30 mg/L、生根培养基1/2MS+6-BA 0.1 mg/L+NAA 0.3 mg/L+柠檬酸30 mg/L是筛选的最合适的培养基。

关键词 蝴蝶兰；外植体；诱导；分化；培养基

中图分类号 S682.31 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2015）08-0162-02

蝴蝶兰为兰科蝴蝶兰属多年生草本植物，其株型美观，枝叶繁茂，花朵硕大，形状奇特，色彩艳丽且开花期长，观赏价值极高，是目前兰科植物中栽培最广泛的种类之一，深受民众喜爱，被誉为“兰中皇后”，同时也是室内绿化美化的新型观赏花卉，具有较高的经济价值和观赏价值。现以蝴蝶兰花梗为外植体，采用不同的培养基进行诱导分化、增殖生根试验，为优良蝴蝶兰品种的选育提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料选自温室栽培蝴蝶兰植株，选取健壮、无病虫害植株的花梗。试验用品与仪器包括75%酒精、0.1%升汞、洗洁精、无菌水、灭菌三角瓶、剪刀、解剖刀、镊子、无菌培养皿、超净工作台。

1.2 试验方法

1.2.1 材料的清洗和消毒。试验材料先用自来水冲洗5 min，然后用洗洁精清洗，再用自来水冲洗30 min。清洗过的材料放入超净工作台，用75%酒精浸泡30 s，再用0.1%升汞溶液浸泡13 min，最后用无菌水冲洗4～6次，最后把材料置于无菌滤纸上吸干水分。这样可使污染率低至5%以下，成活率达到97%以上。

1.2.2 接种。将消过毒的试验材料放入已经灭菌的培养皿中进行切割，切取2～3 cm长带芽节段，每节距侧芽上部1 cm、下部2 cm，并将侧芽苞叶剥去。使用高压灭菌锅灭过菌的玻璃瓶，揭去封口膜，把瓶口置于酒精灯火焰上烘烤数秒钟，并将材料放入玻璃瓶，再次烘烤数秒，然后迅速用封口膜封严[1]，放入冰箱，进行低温冷冻，分别处理12、24 h，最后移入培养室进行培养（所有操作器械在每次使用后均需消毒1次）。

1.2.3 培养基选择。花梗芽的诱导与分化使用的基础培养基分别为MS、VW和1/2MS。采用不同质量与浓度的植物生长调节剂配制的培养基，分别进行诱导与分化增殖，不同培养基对于试验材料产生不同的效果，筛选出以下几种培养基（蔗糖20 g，琼脂粉6.0 g，pH值5.6～5.8）。①诱导培养基：MS+6-BA 3.0 mg/L+花宝1号1.0 g/L+柠檬酸30 mg/L（A）、VW+6-BA 3.0 mg/L+花宝1号1.0 g/L+香蕉泥100 g/L+柠檬酸30 mg/L+活性炭1.0 g/L（B）、VW+6-BA 5.0 mg/L+花宝1号1.0 g/L+香蕉泥100 g/L+柠檬酸30 mg/L+活性炭1.0 g/L（C）。②分化培养基：MS+6-BA 5.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L+椰子汁10%+柠檬酸30 mg/L（D）、VW+NAA 0.3mg/L+香蕉泥100 g/L+柠檬酸30 mg/L（E）。③生根培养基：1/2VW+NAA 0.3 mg/L+柠檬酸30 mg/L（F）、1/2MS+6-BA 0.1 mg/L+NAA 0.3 mg/L+柠檬酸30 mg/L（G）、1/2MS+6-BA 0.2 mg/L+NAA 0.4 mg/L+柠檬酸30 mg/L+椰子汁95 mL/L（H）。

1.2.4 培养条件。培养温度（25±2） ℃，光照强度2 000～3 000 lx，光照时间12 h/d。

2 结果与分析

2.1 培养基的筛选与比较

花梗芽的诱导与分化使用的基础培养基分别为MS、VW和1/2MS。其中，诱导试验过程中A培养基外植体诱导表现突出，出芽率达到90%，出芽最早，萌动只需12 d，形成营养芽需2个多月；分化培养基中，D培养基最适合营养芽分化再增殖，其分化出的丛生芽，芽数多，生长快，健壮，无畸形，且都能生长为小苗；生根培养基中，G培养基能使小苗生长健壮，叶色正常，既没有添加椰子汁，也没有添加香蕉泥，是筛选出的经济且实用的培养基。由此表明，采用不同质量与浓度的植物生长调节剂配制的培养基，分别进行诱导与分化增殖，不同培养基对于试验材料产生不同的效果[2]，MS、VW 2种基础培养基均可作为诱导培养基，但添加不同质量浓度的激素和添加物可以诱导出不同的植物组织器官。

2.2 不同浓度的外源激素对花梗芽增殖和生长的影响

激素是培养基中不可缺少的关键物质，它们对外植体愈伤组织诱导和器官分化起着重要的调节作用，以生长素与细胞分裂素最为常用[3]。因此培养基的使用，对于植物的组培快繁及诱导分化起决定性作用，尤其是生长素与细胞分裂素，生长素包括IAA、IBA、NAA等，细胞分裂素包括BAP、6-BA等。花梗芽的诱导与分化随外源激素的种类和浓度配比的不同而产生不同的结果[4]。用同种基础培养基时，6-BA和NAA同时使用比只使用6-BA诱导率低，萌动出芽时间长。当单独使用6-BA并且浓度为3.0 mg/L时，蝴蝶兰花梗侧芽诱导率较好。当NAA浓度为0.5 mg/L，6-BA浓度为1.0～7.0 mg/L时，营养芽分化为丛生芽的增殖率逐渐提高，当6-BA浓度为7.0 mg/L时，诱导分化的平均出芽数最多，但是有畸形，说明6-BA浓度过高并不能达到较好的效果，只有当6-BA和NAA在合适的浓度下配合使用才能使营养芽分化增殖效果最好。

2.3 花梗芽的诱导与分化

利用花梗段侧芽在A、B、C培养基中诱导营养芽和花葶，培养2～3个月即可形成愈伤组织。若培养过程中培养基消耗过多或褐化严重转接1次，培养基不变，连续3个月进行统计，结果见表1。可以看出，放入玻璃瓶中的花梗段，通过观察发现，30 d以后，侧芽开始萌发，50 d左右长成3～4 cm高带2～3片叶的无菌苗。切取无菌苗，放入培养基中继续观察，20 d后，无菌苗的顶芽、腋芽和下胚轴开始萌动，萌发出1～2个小芽，下胚轴两端形成致密的愈伤组织[5]，45 d后愈伤组织开始变绿，逐渐分化出芽点，最后形成丛生芽。

2.4 丛生芽的分化和增殖

接种到D培养基中的营养芽分化再增殖，最早1个月就可见到芽，50 d左右可长出2～3片叶，当分化出丛生芽后，再采用多芽增殖，仍使用D培养基，周而复始，可获得较大数量的丛生芽，分化增殖出丛生芽只需2个多月，极大地缩短了增殖周期。

2.5 丛生芽壮苗生根

蝴蝶兰分生培养经过1个多月培养出小芽苗，转接到G培养基中进行壮苗生根，大多数生根培养基都可以让小苗生根生长，当芽生长到1.5 cm长时，再将其转入G培养基中，约50 d长出具有根、茎、叶的完整植株，且植株健壮，长势好，生长3个月后达到温室炼苗的要求。

3 结论与讨论

试验结果表明，选育优良的蝴蝶兰品种，筛选品种、外植体入瓶、培养基配制、接种、诱导分化、壮苗生根等一系列的工作，需要1～2年的时间，对培养基成分的筛选和优化是植物组织培养中非常重要的步骤。蝴蝶兰组培快繁的诱导与分化需要大量的花梗芽进行试验，需要不断观察总结。对于植物组织培养的影响因素主要是外植体的选择、环境因子的影响以及培养基的选择。

4 参考文献

[1] 秦凡，周吉源.不同植物生长调节剂对蝴蝶兰快速繁殖的影响[J].武汉植物学研究，2003，21（5）：452-456.

[2] 鲁雪华，郭文杰，徐立晖.蝴蝶兰花梗节间段培养繁殖的初步研究[J].园艺学报，2002，29（5）：491-492.

[3] 安利国.细胞工程[M].北京：科学出版社，2004：169-190.

[4] 谭巍，尤海波，刘博文.蝴蝶兰组织培养中丛生芽增殖的研究[J].黑龙江农业科学，2011（2）：20-21.

[5] 王娟.不同阶段蝴蝶兰标准化栽培技术[J].北方园艺，2007（8）：168-169.