复方硫酸软骨素对大鼠骨质疏松症的治疗作用

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摘要：目的研究复方硫酸软骨素治疗维甲酸诱导的大鼠骨质疏松症的作用。方法随机将大鼠分为空白对照组、模型组、阳性对照组及复方硫酸软骨素高、中、低剂量组。将80 mg/kg剂量维甲酸连续灌胃40 d，诱导大鼠形成骨质疏松模型后开始给药，40 d后收集血液分离血清，测定药物对血清学指标的影响。分离大鼠双侧股骨，测定药物对股骨参数及大鼠骨生物力学的影响。结果与模型组比较，复方硫酸软骨素高、中剂量组能显著增加大鼠体重，提高骨矿含量及骨密度，降低血清碱性磷酸酶（ALP）水平，并能显著改善股骨的生物力学参数。结论复方硫酸软骨素对维甲酸致大鼠骨质疏松症有治疗作用。

关键词：复方硫酸软骨素；骨质疏松；维甲酸

中图分类号：R961文献标识码：A 文章编号：1672-979X(2008)05-0007-04

Effect of Compound Chondroitin Sulfate on Osteoporosis Rats

LIU Xiu-ju1.2, ZHANG Ji-xian2, MU Zhong-xiang3, WANG Shi-li1*

(1. Shandong Medicinal Biotechnology Centre, Key Laboratory for Biotech-Drugs of Ministry of Health, Jinan 250062, China; 2. Shandong Provincial Hospital (Western Division), Jinan 250022, China; 3. Shandong Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250012, China)

Abstract：Objective To study the effect of compound chondroitin sulfate on osteoporosis rats induced by retinoic acid. Methods Sixty Wistar rats were randomly divided into six groups of blank control, osteoporosis model group, positive control and compound chondroitin sulfate (high dose, middle dose and low dose) groups. The osteoporosis of rats was induced by administering 80 mg/kg retinoic acid for 40 days, then all rats were treated with drugs. After 40 days, the blood was collected to detect the influence of drugs on serum index. Femur bone sections of two sides were stripped and the influences of drugs on femur bone parameters and biomechanics were determined. Results Compared with osteoporosis model group, compound chondroitin sulfate (high dose and middle dose) groups could significantly increase body weight of the rats, raise bone mineral content and bone mineral density and could significantly lower the level of serum ALP. Besides, compound chondroitin sulfate (high dose and middle dose) groups could also significantly improves the biomechanics parameters of femur bone. Conclusion Compound chondroitin sulfate has a curative effect on osteoporosis rats induced by retinoic acid．

Key words：compound chondroitin sulfate; osteoporosis; retinoic acid

骨质疏松症（osteoporosis，OP）是以骨量减少、骨显微结构退化为特征，致使骨的脆性增加以及易于发生骨折的一种全身性骨骼疾病。该病严重影响中老年人的身体健康，是临床常见病、多发病。因此，研究防治OP的药物极为重要。

硫酸软骨素（CS）和氨基葡糖（GA）均是氨基糖类化合物。前者存在于动物软骨组织，后者则是天然甲壳素最基本的衍生物之一。研究表明，硫酸软骨素能促进成骨细胞增生和新骨形成[1]；氨基葡糖则能促使骨折愈合促进因子―骨形态发生蛋白（BMP）分泌，使间充质细胞向成软骨细胞和成骨细胞转化[2]。本研究将硫酸软骨素、氨基葡糖、大豆异黄酮及葡糖酸锰组成复方制剂，研究其治疗维甲酸所致大鼠骨质疏松症的作用，为开发新型的骨质疏松治疗药物提供理论依据。

1材料

1.1动物

Wistar大鼠，雌性，3月龄（山东大学实验动物中心提供）。

1.2药物与试剂

复方硫酸软骨素（CCS，本实验室制备，批号20070529，处方组成：硫酸软骨素 200 mg；氨基葡糖250 mg，大豆异黄酮 37.5 mg，葡糖酸锰 2 mg）；维甲酸（重庆华邦制药股份有限公司，批号050706）；依替膦酸二钠片（连云港正大天晴制药有限公司，批号060322）。

1.3仪器

1650全自动生化分析仪（德国拜耳）；HOLOGIC 4500A双能X线骨密度仪（美国）；721型分光光度计（上海第三分析仪器厂）；MC009-WDW01D型微机控制电子万能实验机（山海研润光机科技有限公司）。

2方法

2.1动物分组及造模[3,4]

60只Wistar大鼠，适应1周后称重，随机分成6组，每组l0只，分别为空白对照组、模型组、阳性对照组及CCS高、中、低剂量治疗组。空白组每日灌服蒸馏水10 mL/kg；其他组每日灌服维甲酸80 mg/kg，连续40 d后，腹腔注射0.7 %戊巴比妥钠35 mg/kg麻醉，测定活体全身骨密度以确定造模成功。

2.2给药方法

参考中华人民共和国卫生部《保健食品检验与评价技术规范》（2003年版），以人体推荐剂量的5倍为CCS中剂量，各CCS治疗组剂量分别为600，300，150 mg/kg，制成水溶性混悬液灌胃；阳性对照组给予依替膦酸二钠 50 mg/kg；空白对照组及模型组给予等体积的蒸馏水。各组均从造模成功后次日开始给药，每日给药1次，连续40 d。除空白组外的其余各组，给药期间每周2次灌服维甲酸 80 mg/kg。

2.3标本采集及测定方法

2.3.1血清学指标全自动生化分析仪测定各组大鼠血清中钙、磷及血清碱性磷酸酶（ALP）的含量。

2.3.2骨参数分离大鼠双侧股骨，双能X线骨密度仪用标模标定后扫描分析股骨样品，测定骨矿含量（BMC）、骨影面积（EARE）和骨密度（BMD）。

2.3.3骨生物力学双侧胫骨经福尔马林固定后在微机控制电子万能实验机上做3点弯曲实验，加载点位于胫骨上1/3处，两侧支点标距为24 mm，实验机匀速加载，加载速度为2 mm/min。检测（1）最大载荷（骨断裂前所承受的最大力值）；（2）最大挠度（骨断裂前所产生的最大变形长度）；（3）最大应力（骨标本单位面积承受的最大载荷值）；（4）伸长率（在载荷作用下骨标本的变形与标距之比，表示骨的塑性能力）。

2.4统计方法

计量资料用－x±s表示，各给药组与对照组之间差异用t检验。

3结果

3.1维甲酸造模后大鼠全身骨参数的变化

按2.1造模，测定空白组和造模组大鼠的体重、全身BMC、EARE及BMD，结果见表1。结果表明，造模大鼠体重下降，全身BMC、EARE及BMD均明显降低。与空白组大鼠比较，差异有统计学意义（P＜0.05），表明造模成功。

3.2CCS对大鼠血清学指标的影响

测定结果见表2。模型组大鼠血清中ALP水平较空白组明显升高；阳性对照组ALP水平与空白组相当，明显低于模型组；CCS高、中、低剂量组ALP水平均高于阳性对照组，但差异无统计学意义（P＞0.05）。各组血清中钙和磷的水平不尽相同，但差异无统计学意义（P＞0.05）。

3.3CCS对大鼠骨参数的影响

造模成功后开始给药，40 d后测定各组大鼠的体重及股骨的BMC、EARE及BMD，结果见表3。模型组大鼠体重下降，股骨BMC、EARE及BMD与空白组对照明显降低，差异有显著的统计学意义（P＜0.01）；服用依替膦酸二钠后，大鼠体重、BMC、AERE及BMD与模型组比较均明显增加，差异有统计学意义（P＜0.05）。与空白组比较依替膦酸二钠组各测定指标稍低，但差异无统计学意义（P＞0.05）。CCS高、中剂量组大鼠体重、BMC、EARE及BMD等测定指标差异不明显，大部分测定指标高剂量组稍高，但差异无统计学意义（P＞0.05）。与空白组比较，CCS高、中剂量组测定的各指标数据偏低，但差异无统计学意义。CCS低剂量组与空白组比较，各数据明显较低，差异有统计学意义（P＜0.05）。

CCS高、中剂量组大鼠体重、BMC、EARE及BMD等指标与模型组比较明显增高，差异有统计学意义（P＜0.05），表明CCS高中剂量治疗骨质疏松有显著疗效。 低剂量组各测定指标也均高于模型组，但差异无统计学意义（P＞0.05），表明低剂量组并不能显著改善大鼠骨质疏松的症状。

CCS高、中、低3个剂量组的实验数据表明，高、中剂量组各指标均明显好于低剂量组，差异有统计学意义（P＜0.05），考虑到高、中剂量组实验结果的差异不显著，因此，可把中剂量组作为最理想的应用剂量。

3.4CCS对大鼠骨生物力学的影响[5]

测定结果见表4。模型组各项指标的数据均小于空白组，且两组测定结果比较差异有统计学意义（P＜0.05）。

依替膦酸二钠组各项指标的数据与空白组不同，但统计表明差异并无统计学意义（P＞0.05）；依替膦酸二钠组各测定结果均高于模型组，且两组测定结果的差异有统计学意义（P＜0.05）。

CCS高、中剂量组各指标测定结果基本一致，统计显示两组结果没有显著差异（P＞0.05）。此外，高、中剂量组与空白组各指标的测定结果相当，经统计学处理表明，两组测定结果也没有显著差异（P＞0.05）；CCS高、中剂量组各项指标测定结果明显高于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05）；与依替膦酸二钠组各指标测定结果基本相当，统计结果没有显著差异（P＞0.05）。

CCS低剂量组各指标测定结果明显低于高、中剂量组及空白组和依替膦酸二钠组，统计表明低剂量组测定结果与以上各组差异显著（P＜0.05）；低剂量组测定结果均高于模型组，但统计表明两组差异无统计学意义（P＞0.05）。

4讨论

维甲酸所致的大鼠骨质疏松模型是研究动物骨质疏松经常采用的一种疾病模型，此模型在发病症状、组织形态学表现以及对雌激素的骨反应上与人类有较好的相似性[6]。因此，采用此模型能较客观地评价CCS对骨质疏松症的治疗作用。本研究结果表明，大鼠服用维甲酸40 d后，即能产生明显的骨质疏松症状。

治疗40 d后，依替膦酸二钠能显著改善大鼠骨质疏松的症状，与文献[7] 结论一致。虽然依替膦酸二钠组股骨参数的测定指标与空白组比较没有显著差异，但仍低于空白组，或者这可能是由于治疗没有达到足够的时间，某些参数指标还没有完全恢复，或者可能是长期大量服用维甲酸后，随着骨中某些矿物质的流失，骨结构发生了变化，即使补充钙等矿物质，骨参数也难以恢复到原来的程度。骨质严重疏松的老年人，再用药物长期治疗后骨质参数难以恢复到以前的程度，也可能有类似的原因。

在CCS对骨质参数的影响实验中，高、中剂量组治疗效果差异不显著，提示在实际应用中，可用中等剂量作为治疗的最佳剂量，以避免过多应用药物，造成不必要的浪费。此外，低剂量组虽有治疗效果，但并不显著，表明低剂量不能使骨质疏松症状明显改善，建议不予采用。

本处方中添加了大豆异黄酮，这是从大豆中提取的天然成分，是一种植物雌激素，具有雌激素样作用，但无雌激素的副作用，在骨代谢中非常活跃[8，9]。雌激素主要抑制骨吸收，异黄酮可明显增进骨母细胞，增强骨骼生长的活力，并有抑制蚀骨细胞的功能。对于年长的女性由于体内雌激素减少会使BMD降低，易患骨质疏松症，长期使用大豆异黄酮治疗是安全的，可以提高BMD，还能预防老年骨质疏松患者骨折。

锰是糖基转移酶（glycosytransferase）必要的辅助因子。在硫酸软骨素和氨基葡糖配方中适量加入锰，可促进软骨组织的形成。

参考文献

[1]Nishimoto S, Takagi M, Wakitani S, et al. Effect of chondroitin sulfate and hyaluronic acid on gene expression in a three-dimensional culture of chondrocytes[J]. J Biosci Bioeng, 2005, 100(1): 123-126.

[2]Harrs S E，Bonewald L F，Harrs M A，et a1．Effects of transforming growth factor beta on bone nodule formation and expression of bone morphogenetic protein 2, osteocalcin, osteopontin, alkaline phosphatase, and type I collagen mRNA in long-term cultures of fetal rat calvarial osteoblasts.[J]．J Bone Miner Res，1994，9(6)：855-863.

[3]陈奇. 中药药理研究方法学[M]. 北京：人民卫生出版社，1994：377-379.

[4]徐叔云. 药理实验方法学[M]. 第2版. 北京：人民卫生出版社，1993：525-531.

[5]王惠明，李晶，李 平. 山茱萸总甙对去势大鼠骨生物力学影响的实验研究[J]. 吉林中医药，2007，27（6）：49-50.

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[8]张延坤，马燕. 大豆异黄酮的特性及其特殊生理功能[J].预防医学杂志，2003，21（4）：307-310.

[9]李文仙，刘兆平，于波，等. 大豆异黄酮加钙复合剂对卵巢切除大鼠骨密度和骨钙含量的影响[J]. 中国食品卫生杂志，2003，15（4）：308-310.