苯酚-硫酸法测定蛹虫草中多糖含量
开篇：润墨网以专业的文秘视角，为您筛选了一篇苯酚-硫酸法测定蛹虫草中多糖含量范文，如需获取更多写作素材，在线客服老师一对一协助。欢迎您的阅读与分享！
蛹虫草（Cordyceps militaris）,别名北冬虫夏草、北虫草。野生蛹虫草具有多种药用价值、滋补功能，可与人参、鹿茸相媲美。其所含的虫草素、甘露醇、SOD等成分，均达到或超过名贵中药冬虫夏草。具有抗疲劳、抗衰老、增强免疫和等作用，可杀灭喉癌细胞，能补肺益肾壮阳，有扶虚损、益精气、止血、化痰、镇静、免疫等多种功能。其有效活性成分虫草多糖(CMPS)被认为是非特异性免疫调节剂,可激活肌体的免疫活性细胞。本文通过苯酚-硫酸法,测定蛹虫草中多含量，此方法简便、结果准确、重现性好、颜色稳定。因此，可采用苯酚-硫酸法测定蛹虫草中多糖含量。
1材料与方法
1．1材料
蛹虫草由抚顺师专生化系蛹虫草课题组提供。
1．2仪器与试剂
浓硫酸（GR）95%乙醇和无水葡萄糖均为市售分析纯。苯酚试剂： 取苯酚(CP> 200 g 、加铝片0．2 g和碳酸氢钠0．1 g，蒸馏，收集180 ℃左右馏分。将新蒸苯酚配成6%溶液，放入棕色瓶，置于冰箱中保存备用。其它均为分析纯。
UNIC7200型分光光度计(上海尤尼科仪器有限公司)
1．3方法
1．3．1蛹虫草多糖的提取与精制
新鲜的蛹虫草，烘干，粉碎后，用无水乙醇提取数次，残渣风干。取适量干粉，放于磨口三角瓶中，按料水比1∶20，在温度100 ℃的热水浴中回流浸提2 h，冷却后离心，合并上清液。上清液用酶法去除淀粉，按20 U/g加液化酶到上清液中，在pH为6，温度为65 ℃的水浴条件下处理，用I2/KI溶液检验，直到碘液不变色为止。接着用Sevag法除去蛋白质，在水浴挥去有机相，H2O2除色，然后加3倍体积95%乙醇溶液，冷冻离心机离心，冷冻干燥即得精制CMPS。
1．3．2葡萄糖标准曲线的测定
精确称取105℃干燥恒重的葡萄糖100 mg，置于100 ml容量瓶中定容，摇匀。取10 ml溶液于100 ml容量瓶中定容，摇匀(含葡萄糖100 μg/ml)，备用。分别吸取葡萄糖标准溶液0．1、0．2、0．3、0．4、0．5、0．6、0．7、0．8 ml,用蒸馏水补充至2．0 ml加入5%的苯酚溶液1 ml，摇匀，加入浓硫酸5 ml室温下放置10 min，于490 nm处测定吸光度值(以2．0 ml蒸馏水作为空白)，得到回归方程为：
A=0．009 1Cr=0．997 6
其中：A为吸光值，C为葡萄糖浓度
1．3．3样品液的制备
称取用无水乙醇处理过的蛹虫草干粉10 g，按照最优提取方案进行提取，除淀粉，除蛋白，用95%的乙醇沉淀，4 000 r/min离心，沉淀用蒸馏水溶解，用500 ml的容量瓶定容，即得样品液。
1．3．4换算因子的测定
精密称取干燥至恒重的精制CMPS粉末5mg，置于50 ml容量瓶中，加水溶解至刻度，摇匀备用。精密量取该贮备液1．0 ml，按照“1．3．2”的方法测定吸光度，计算出多糖中葡萄糖的浓度，按下式计算出换算因子，F=W/(C.D)，W为多糖重量(mg)，C为多糖中葡萄糖的浓度(mg/ml)，D为多糖的稀释因素，测得F=2．031(n=3)。
1．3．5稳定性试验
取样品供试液，按葡萄糖标准曲线测定方法，将同一份反应液间隔一定时间，测定吸光值。
1．3．6精密度试验
取样品供试品溶液，按葡萄糖标准曲线所述的含量测定方法，重复测定5次，记录吸光值。
1．3．7回收率试验
采用加样回收法。吸取多糖样品溶液0．5 ml，分别加入标准葡萄糖溶液0．1、0．2、0．3、0． 4 、0．5 ml，按照上述方法分别测其吸光度，根据葡萄糖的检出量，计算其回收率。结果见表1。回收率=(实验测值-样品所含被测成分量)/加入纯品量*100％
1．3．8多糖含量的测定
吸取样品液1．0 ml，用重蒸水定容至100 ml，取定容液1．0 ml，按上述步骤操作，同时做5个重复，测吸光度，以标准曲线和下式计算样品中多糖的百分含量。多糖含量(%)=C.D.F/w
C为供试液葡萄糖浓度，D为供试液的稀释因素，F为换算因素，W为供试品的重量。
2结果与分析
2．1稳定性试验结果间隔10、20、30、40、60 min测定的吸光度分别为0．448、0．449、0．448、0．450、0．449。稳定试验RSD为0．167% ，表明样品在60 min内稳定性良好。
2．2精密度试验结果测定1、2、3、4、5次吸光度值分别为0．445、0．443、0．447、0．444、0．445
精密度试验RSD为0．298% ，表明仪器精密度良好。
2．3回收率测定结果表１表明：本试验的RSD为0．36%，表明本方法的准确率较高。
2．4多糖含量测定结果表２表明：测得蛹虫草多糖含量为13．3%,RSD为0．21%，表明结果准确。
3小结与讨论
3．1本试验采用苯酚-硫酸法，此方法简便、结果准确、重现性好、颜色稳定。因此，可采用苯酚-硫酸法测定蛹虫草中多糖含量。
3．2本试验在测定过程中发现，硫酸最好是用优级纯，同时在测定过程中无须加热，因为，在加入硫酸的过程中硫酸与溶液中水作用，放出大量热，完全能够满足反应需要。
参考文献
1徐锦堂.中国药用真菌学.北京医科大学，中国协和医科大学联合出版社，1997：16-394.
2可世麟,赵春桂.苯酚-硫酸比色定糖法的应用.生物化学与生物物理进展,1986,(5):68-69.
3倪立坚,蒋小等.石斛中石斛多糖提取工艺的优选.海峡药学,2000,12(4):20-22.
4董群，郑丽伊，方积年．改良的苯酚-硫酸法测定多糖和寡糖含量的研究.中国药学杂志，1996，31(9)：550-551.
注：“本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文”