中药YN-3号对慢性应激大鼠行为学及海马GR NMDAR表达的影响
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摘要：目的：探讨中药yn-3号对慢性应激模型大鼠抑郁状态相关行为学的影响及其作用机制。 方法：40只SD大鼠分为空白组、模型组、YN-3组和氟西汀组，应用慢性复合应激方法造模，进行抑郁状态相关行为学检测，包括Open-field实验，强迫游泳实验和“Y”迷宫实验。免疫组化方法检测海马内gr、nmdar表达情况。 结果：与空白组比较，模型组大鼠的探究活动减少(P
关键词：中药YN-3号；慢性应激；GR；NMDAR
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1673-7717(2008)04-0727-03
体内糖皮质激素的分泌具有自身逆反馈调节的特点，其分泌主要受HPA轴（下丘脑-垂体前叶-肾上腺皮质轴）调节，糖皮质激素在血液中浓度的增加反过来又可以抑制下丘脑和垂体前叶，从而减少糖皮质激素的分泌。海马中富含GR（糖皮质激素受体），可以抑制应激条件下HPA轴的过度反应。创伤性应激和慢性应激均可导致海马GR含量改变，报道中创伤性的应激主要引起海马GR表达的升高[1]；慢性应激损伤实验显示，应激早期海马内GR表达增强，慢性应激后期阳性表达减少[2]。海马GR除了可以自我调节，还受到NMDAR (N-甲基-D-天冬氨酸受体)的影响，两者都对HPA轴和LTP(海马神经元长时程增强效应)有影响，参与应激和学习记忆[3]。本实验观察慢性应激对大鼠一系列行为学活动的影响效应，包括自主运动、强迫运动和学习记忆活动，同时观察中药YN-3号对这一过程的干预作用。
1对象和方法
1.1实验动物与分组
雄性SD大鼠，体重160～180g（北京维通利华实验动物养殖中心），筛选40只，随机分为4组，每组10只，分别为：空白组（control）、模型组(model)、YN-3组(YN-3)、氟西汀组(Prozac)。
1.2主要实验器材和药品
Noduls Ethovision软件及摄像系统（荷兰Noldus information technology 公司,型号：NOVELBAC）；MG-3Y迷宫刺激器（张家港生物医学仪器厂）；氟西汀(百优解，片剂，美国礼来公司，批号A019602）。
1.3模型建立
造模各组孤养并每日随机给予以下刺激的一种：断食（24h）、断水（24h）、昼夜颠倒（24h）、夹尾（3min）、束缚（3h）、10℃冷水游泳（5min）、电击足底（电压为30V，电击5s，间歇5s共进行300s），共21天。
1.4治疗组处理方法
YN-3组灌胃，使用前按照灌胃剂量煎药浓缩,浓度1.00g/mL，贮存于4 ℃冰箱中备用，用前加热。氟西汀组于每日进行应激刺激前1h灌胃给药，用药量为1.8mg/kg，按1mL/100g给药，共21天。
1.5行为学检测
1.5.1Open-Field实验使用Noduls Ethovision软件及摄像系统对大鼠3min内在小箱中进行的总路程、站立次数进行记录。每只大鼠行为的检测在区域为80cm×80cm的开放场内，由红外摄像系统和视频合成器记录大鼠的活动情况, 计算机分析系统分析大鼠的运动轨迹。
1.5.2强迫游泳实验
1.5.3“Y”型电迷宫实验应用MG-3Y迷宫刺激器，测试成绩分为学习成绩和记忆成绩。宫箱设有3条通道，每臂末端有信号灯，箱底通以交流电。灯光指示为安全区，不通电。将大鼠置于一支臂端，另两支任意一支给灯光信号，示安全区。适应1min后给予电击，以大鼠直接逃至安全区为正确反应，否则为错误。学习成绩以大鼠达到连续9次以上正确反应时所需的电击总次数为准，记忆成绩以学习完后再电击10次中正确反应的次数（N/10）为准，于应激前后记录测试成绩。
1.6GR NMDAR免疫组化染色和图像分析
断头后迅速取脑并切取含海马脑段，浸入4％多聚甲醛液中固定，石蜡包埋，额状连续切片，片厚5μm，每只动物间隔取片，每个指标取3张，常规SABC法染色：常规脱蜡和水化，兔抗GR、NMDAR单克隆抗体（1∶100，北京博奥森生物技术有限公司）室温60min，生物素标记二抗室温孵育15min，链霉菌抗生物素－过氧化物酶溶液室温15min，DAB溶液显色（以上SP超敏试剂盒由福州迈新生物技术开发有限公司）。光镜下，归类每张切片海马CA1、CA2、CA3、齿状回等4个亚区的阳性细胞强度，以每100个细胞中阳性细胞个数为标准，分为阴性(n=0)、弱阳性(0
1.7统计学处理
行为学成绩均用均值±标准差(±s)表示，用独立样本t检验(Independent-Samples T Test)做组间差异显著性分析；图像分析结果用多个样本比较的秩和检验(Kruskal-Wallis法)和多个样本两两比较的秩和检验(Nemenyi法)。
2结果
2.1中药YN-3号对大鼠Open-Field实验的影响
3min内大鼠活动的总路程和站立次数见表1。结果显示：与空白组比较，模型大鼠活动总路程显著下降(P
2.2中药YN-3号对大鼠强迫游泳实验的影响
强迫游泳实验成绩见表2。结果显示与空白组比较，应激使模型大鼠的游泳不动时间显著下降(P
2.3中药YN-3号对大鼠“Y”型电迷宫实验的影响
学习和记忆成绩见表3。结果显示应激使模型大鼠的学习、记忆能力大幅度下降(P
2.4中药YN-3号对大鼠海马内GR阳性表达强度的影响
光镜下可见海马细胞阳性表达呈褐色,位于细胞质内，多见于锥体细胞层，个个亚区都有一定表达，但主要分布于海马CA1区。具体表达情况见表4，查χ2界值表得P
2.5中药YN-3号对大鼠海马内NMDAR阳性表达强度的影响
表达情况基本与GR一致，但阳性表达密集的区域主要有CA1、CA3区，具体情况见表5。查χ2界值表得P0.05；χ2m,N＝29.36，P
3讨论
过度的应激会引起HPA轴亢进，机体出现应激紊乱，会导致严重的继发性损害，例如对周围事物的兴趣降低、生存欲望和学习记忆能力下降等。海马内富含两种肾上腺皮质激素受体：盐皮质激素受体(MR)和糖皮质激素受体(GR)，MR主要参与基础水平的HPA轴的调节，GR则抑制应激条件下HPA轴的过度反应[4]。GR的调节与NMDAR介导的突触传递有着某种密切联系。从应激的角度看，海马是HPA轴调节的高位中枢，是应激累及的敏感部位；从学习记忆的角度来看，海马是参与学习记忆的重要部位，而海马的这些作用均有GR和NMDAR的介入[5]。
本文研究慢性应激下GR与NMDAR之间的作用关系，结果显示慢性应激使大鼠海马内GR的表达强度降低，而同时NMDAR的表达强度也降低。对于GR表达降低的解释可能是一种过度刺激的产生的脱敏反应，就是当机体受到应激原的刺激的早期，内源性GC（糖皮质激素）水平升高，而GR也随之增高，当应激原持续存在，累计强度过大、持续时间过长时， GC始终保持较高水平，导致GR敏感度降低，免疫强度减弱，继而耗竭而表达减少。海马GR表达降低，使得其对HPA轴的负反馈作用减弱，加重机体的损伤反应。
既往报道认为急性应激或创伤性应激时GR的降低受NMDAR受体通道活性增强的影响[6-7]，表现为在阻断NMDAR通道之后，GR表达降低的程度明显减弱。本次实验的结果并不支持在慢性应激的情况下GR表达降低的同时NMDAR的活性增强，而是出现相反的结果。虽然两种受体在海马各个亚区的分布情况较为一致，但NMDAR的表达强度呈现出下降的表现。这一结果提示如下问题：在慢性应激的条件下是否存在另一条通路可以影响GR的含量下降，并且NMDAR通道的一系列病理性效应，如兴奋性毒性，在应激的后期是否还继续存在。但无论答案怎样，中药YN-3号在本次实验中的抗抑郁学改变的作用表现的很明显，且对两种受体的表达有趋向正常组的调节作用。
参考文献
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