蟾酥醇提取物的体外抗炎作用研究

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摘要：为了考察蟾酥醇提取物的体外抗炎作用，用LPS诱导RAW 264.7细胞和小鼠腹腔巨噬细胞建立细胞炎症模型，采用Griess法测定蟾酥醇提取物对细胞上清液中的NO水平，ELISA法测定TNF-α、IL-lβ、IL-6含量，荧光法测定细胞内ROS水平。结果显示，蟾酥醇提取物对LPS诱导的RAW264.7细胞和小鼠腹腔巨噬细胞所分泌的炎症因子（NO、TNF-α、IL-1β、IL-6）有明显的抑制作用，与空白对照组相比明显降低，同时蟾酥醇提取物极显著降低LPS诱导的细胞内ROS水平（P

关键词：蟾酥醇提取物；RAW 264.7细胞；小鼠腹腔巨噬细胞；体外抗炎；炎症因子

中图分类号：R282.74 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）11-2843-03

DOI：10.14088/ki.issn0439-8114.2016.11.032

蟾酥别名又称蛤蟆浆、蛤蟆酥、蟾酥眉脂[1]。蟾酥辛温，有毒，具解毒、开窍醒神和止痛之功效。现代药理研究表明，蟾酥具有抗肿瘤、抗放射、改善全身状况、抗炎、恢复细胞免疫功能、提升白血球、缓解癌性疼痛等药理作用[1]。蟾酥具有良好的抗炎作用，但是当前针对蟾酥抗炎的报道多集中在蟾酥制剂的抗炎水平[2，3]，对蟾酥分类、分段提取物的抗炎研究并不多见。在前期研究中，笔者对蟾酥进行了醇处理，获得了主要成分为脂溶性华蟾酥毒基和酯蟾毒配基的蟾酥醇提取物。因此，本研究的主要目的是以脂多糖（LPS）诱导RAW 264.7细胞和小鼠腹腔巨噬细胞建立炎症细胞模型，初步探讨蟾酥醇提取物的体外抗炎作用，为更进一步的研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 药物与试剂

蟾酥醇提取物的制备：将蟾酥粉碎，取蟾酥粉末按质量体积比加10倍量95%乙醇，浸泡7 d，离心，取上清液，过滤，滤液即为蟾酥醇提取物，经HPLC检测每1 mL含华蟾酥毒基和酯蟾毒配基分别为119.96 μg/μL和85.22 μg/μL。

细胞株：小鼠单核/巨噬细胞株RAW264.7购自中国医学科学院基础医学研究所细胞库。

试剂：RPMI-1640培养基、DMEM培养基、新生牛血清、0.05%胰蛋白酶-EDTA均为Gibco产品；（MTT）、L-谷氨酰胺、LPS均为Sigma公司产品；活性氧试剂盒购自北京普利莱基因技术有限公司；TNF-α、IL-lβ、IL-6细胞因子检测试剂盒均购自于上海劲马生物科技有限公司；PBS购自索莱宝生物科技有限公司；DMSO购自楚杰生物科技有限公司。

1.2 RAW264.7细胞的培养

复苏后的RAW264.7细胞培养于含体积分数为0.1的胎牛血清的DMEM培养基，置37 ℃、5% CO2培养箱培养。传代3次以上，细胞进入对数生长期，即用于试验。

1.3 小鼠腹腔巨噬细胞的制备

给小鼠腹腔注射6%无菌淀粉溶液，48 h后颈椎脱臼处死小鼠，于75%乙醇中浸2～3 min，剪开腹部，暴露腹膜，缓慢注入PBS，吸取腹腔液。重复灌洗2～3次，灌洗液1 000 r/min离心5 min，加入Tris-NH4Cl，于培养箱内孵育10 min，1 000 r/min离心 5 min，用PBS洗1次，用无血清 RPMI-1640培养液洗1次，用 RPMI-1640完全培养液悬浮细胞，200 μm滤网过滤，计数巨噬细胞，台盼蓝染色活细胞>95%，调整细胞浓度为5×106个/mL。

1.4 分组与处理

细胞于37 ℃、5% CO2培养箱培养至次日，弃上清，每孔加入400 μL或200 μL的不同剂量的蟾酥醇提取物（用培养液稀释），在培养箱内孵育1 h后加入10 μL终浓度为10 μg/mL的LPS。试验设蟾酥醇提取物（以华蟾酥毒基成分计）高剂量组（24 mg/L）、中剂量组（12 mg/L）、低剂量组（6 mg/L）、空白对照组、LPS对照组，每组4个重复。

1.5 MTT法检测蟾酥醇提取物对细胞存活率影响的检测

细胞以1×106个/mL的密度接种于96孔细胞培养板过夜，作用48 h后，每孔加入10 μL MTT（浓度为5 mg/mL），在培养箱内孵育4 h，弃上清，每孔加入100 μL DMSO，微振荡10 min后测定OD490 nm。

1.6 Griess法测定细胞上清液中的NO水平

药物作用细胞24 h后收集细胞上清液。于96孔板中每孔加入50 μL细胞上清液，再分别加入 50 μL Griess ReagentⅠ和50 μL Griess ReagentⅡ，微振荡摇匀，避光反应10 min，测定OD450 nm。

1.7 ELISA法检测细胞上清液中的TNF-α、IL-lβ、IL-6含量

药物作用细胞24 h后取细胞上清液，按照ELISA试剂盒说明书进行操作，测定TNF-α、IL-lβ、IL-6含量。

1.8 荧光法检测细胞内ROS水平

按照活性氧检测试剂盒说明书操作。药物作用细胞8 h后，用PBS洗2～3次，每孔加稀释1 000倍的探针液200 μL，于培养箱内孵育30 min，弃去探针，PBS洗3次以上，每孔加500 μL PBS，用细胞刷把细胞刷下，吹匀，每孔取100 μL到荧光酶标板，避光，用荧光酶标仪（激发波长488 nm，发射波长525 nm）测定荧光强度。

1.9 数据分析

试验数据用SPSS17.0软件进行分析，结果用“平均数±标准差”表示，组间比较采用单因素ANOVA分析及t检验。

2 结果与分析

2.1 蟾酥醇提取物对细胞存活率的影响

由图1可知，蟾酥醇提取物在6～24 mg/L（最大浓度）范围内镜下观察细胞形态无改变，各给药组的OD490 nm与空白对照组比较无显著差异，表明该药物在此剂量范围内无显著细胞毒性作用。

2.2 蟾酥醇提取物对细胞释放NO的影响

由图2可知，LPS刺激后，细胞上清液中产生了大量的NO，而高、中、低剂量的蟾酥醇提取物皆极显著抑制NO的释放（P

2.3 蟾酥醇提取物对细胞分泌TNF-α、IL-lβ、IL-6的影响

由图3、图4、图5可知，空白对照组的两种细胞上清液中的TNF-α、IL-lβ、IL-6水平较低，在添加了10 μg/mL LPS后浓度明显增加，而当有蟾酥醇提取物存在后，TNF-α、IL-lβ、IL-6的分泌受到明显抑制，并存在一定的量效关系。

2.4 蟾酥醇提取物对细胞内ROS的影响

由图6可知，LPS可诱导细胞产生大量的ROS，而药物作用后，高、中、低剂量蟾酥醇提取物极显著降低RAW264.7细胞和腹腔巨噬细胞的ROS水平（P

3 讨论

LPS是革兰氏阴性菌细胞壁的组成成分，又称内毒素。内毒素所致炎症反应是复杂的病理生理过程，多细胞因子通过调节促炎和抗炎系统之间的平衡而参与炎症发生、发展过程。研究表明，经LPS刺激后，机体首先表达TNF-α，然后引起巨噬细胞、单核细胞、中性粒细胞和内皮细胞分泌其他细胞因子[4]。在天然免疫中，LPS可直接刺激单核吞噬细胞产生细胞因子，而细胞因子可调节其他类型细胞功能，在介导炎症反应中有重要作用。

Lang等[5]发现在活化的巨噬细胞，IL-10的分泌增加且抑制TNF-α、IL-1β、IL-6的合成。本试验研究发现蟾酥醇提取物不同程度地抑制LPS诱导的RAW264.7和小鼠腹腔巨噬细胞的TNF-α、IL-1β、IL-6浓度，但这种抑制作用是否促进了IL-10的合成还有待进一步的研究。在急性和慢性炎症中，NO是重要的致炎因子[6]。它是由一氧化氮合酶（NOS）催化合成。目前已知3种NOS，分别为神经型（nNOS）、内皮型（eNOS）和诱导型（iNOS）[7]。iNOS在炎症和前致炎因子的诱导下表达量增高，并对炎症过程产生重要影响。本试验结果发现蟾酥醇提取物明显抑制了NO的合成。由此推测蟾酥醇提取物的抗炎效应与抑制炎性细胞因子产生有关。

自由基是机体内的一种不可缺少的活性元素，对生物体既有益又有害。正常情况下，生物体内有一套完整的抗氧化体系，可以维持自由基的代谢平衡。但当机体在某些疾病或外源性物质入侵后，自由基代谢可能会发生异常，从而诱发脂质过氧化反应，并可能导致组织细胞发生氧应激性损伤[8-10]。本试验研究结果显示，LPS可诱导细胞产生大量ROS，但当蟾酥醇提取物存在时细胞内ROS水平极显著降低，初步推测蟾酥醇提取物可能是通过抗氧化的作用从而对抑制细胞的炎性反应，改善细胞的状态。

本研究结果显示，与空白对照组相比，经LPS诱导的细胞的炎症因子TNF-α、IL-1、和NO的分泌水平明显增加、细胞内ROS水平极显著升高，表明体外炎症模型构建成功。蟾酥醇提取物对LPS诱导的RAW264.7细胞和小鼠腹腔巨噬细胞所释放的炎症因子（NO、TNF-α、IL-1β、IL-6）有明显的抑制作用，同时极显著降低细胞内ROS水平。由此表明，蟾酥醇提取物通过抑制炎症因子、降低细胞内活性氧水平减轻细胞的炎症反应，具有良好的抗炎作用，且其抗炎效果具有一定的量效关系。其对炎症因子的抑制作用为进一步研究蟾酥醇提取物抗LPS机制打下良好基础，也为蟾酥醇提取物进一步的开发应用提供了理论依据。

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