当代生物技术在镰刀中的实用性

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作者：柳凤 詹儒林 韦继光 常金梅 单位：广西大学农学院

1分子生物学技术的应用

以分子生物学为基础建立的系统学种能弥补形态学种的一些不足，能比较科学的反映镰刀菌的系统发育，也能为菌种的快速分子检测和鉴定提供科学基础和技术方法。系统学种是在形态种的基础上，根据DNA序列建立系统发育树，在一定水平上处于同一单元进化群的群体被认为是同一种[9]。目前DNA分子标记和主要位点基因序列分析等分子生物学技术在进行镰刀菌小种群体遗传分析及鉴定已经被证明是良好的分子手段[10-11]。1.1DNA分子标记在镰刀菌分类中的应用分子标记(molecularmaker)是以蛋白质、核酸分子的突变为基础，检测生物遗传结构与其变异。DNA分子标记技术从本质上讲，都是以检测生物个体在基因或基因型上所产生的变异来反映生物个体之间的差异。每一种分子标记都有其自身的特点和特定的应用范围，但就一般意义而言，DNA分子标记与形态标记(morphologicalmaker)和生化标记(biochemicalmaker)等相比，具有不受环境、组织类别、发育阶段等影响、标记数量多、多态性高、技术简单、快速、易于自动化及提取的DNA样品可长期保存等许多独特的优点[12]。目前用于镰刀菌分类研究的DNA分子标记有限制性片段长度多态性(restrictionfragmentlengthpolymorphisms，RFLP)、随机扩增多态DNA(randomamplifiedpolymorphicDNA，RAPD)技术[13]、扩增片段长度多态技术(amplifiedfragmentlengthpolymorphism，AFLP)，又名限制片段选择扩增技术(selectiverestrictionfragmentamplification，SRFA)[14-15]、简单重复序列(simplesequencerepeat，SSR)、内部简单重复序列(inter-simplesequencerepeat，ISSR)，又名加锚微卫星寡核苷酸(anchoredmicrosatelliteoligonucleotides，AMP-PCR)技术，加锚简单重复序列(anchoredsimplesequencerepeats，ASSR)[16-17]和单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism，SNP)[18]等。Arabi利用IRAP分子标记技术对24个镰刀菌（8个黄色镰刀菌、4个茄类镰刀菌、9个拟轮枝镰刀和3个木贼镰刀菌）进行了遗传多样性分析，共获得844条带，其中多态性条带421(49.88%)。聚类结果和遗传相似性数据分析显示，供试菌株可形成4个类群，且这些类群的形成与菌株的地理来源之间无相关性[19]。王建明等[20]为了明确美丽组中尖孢镰刀菌和芬芳镰刀菌2种菌的遗传差异性和亲缘关系，利用ISSR分子标记技术对这2种菌的35个菌株进行了遗传多样性分析。结果表明，用筛选的15条引物对35个供试菌株共扩增出231条条带，其中多态性条带220条，平均多态性比率为95.2%，平均每条引物产生条带为14.7条。聚类结果和遗传相似系数分析显示，35个菌株间的遗传相似系数范围为0.506~0.935，平均为0.661。在遗传相似系数为0.593时，供试的35株镰刀菌可明显的分成2个ISSR类样(IG)，其IG1包括1~23号菌株，全部为F.oxysporum。IG2包括24~35号菌株，全部为F.redolens。ISSR类样划分与菌种分类之间存在一定相关性（IG1中23株F.oxysporum间的平均相似系数为0.720，IG2中12株F.redolens间的平均相似系数为0.717），但与菌株的地理来源不存在相关性。而同一类群中，菌株之间的遗传相似性与菌株的地理来源存在一定的相关性。1.2主要位点基因在镰刀菌分类中的应用镰刀菌属系统学研究的主要基因位点有rDNA基因[21]、线粒体小亚基核糖体(mitochondrialsmallsubunitrDNA，mtSSU)[22]和编码蛋白基因：β-微管蛋白(β-tubulin)[23]、EF-lα延伸因子(nucleartranslationelongationfactor-lα，EF-lα)、钙调蛋白(calmodulin)和组蛋白H3等。目前应该较多的是核基因组rDNA和EF-lα延伸因子[24]。有时可通过单基因位点的最大简约性分析就可以说明一些问题；有时对某些问题的探讨则需要对多个基因位点统一进行分析[25-26]。Kwon等[27]经β-微管蛋白、钙调蛋白、线粒体小亚基核糖体和EF-lα延伸因子等序列分析，将引起幼苗腐烂的小麦内生菌NRRL31071鉴定为层出镰刀菌F.proliferatum。1.2.1rDNA序列分析rDNA也称为核糖体DNA，它是指rRNA基因群中的一个重要单位，其最大优点是由于rDNA基因编码序列具有保守性，所以最能反映真菌间的遗传关系，是理想的真菌分类与鉴定指标之一。rDNA包括5.8SrRNA、18SrRNA和28SrRNA的基因及其相邻的间隔区、非转录区。对大多真核生物而言，rDNA包括非转录区(nontranscribedspacer，NTS)、外转录间隔区(externaltranscribedspacer，ETS)、18SrDNA、转录间隔区(internaltranscribedspacer，ITS（)包括5.8SrRNA基因序列）分析的可为真菌种间及种下分类鉴定提供依据[28-29]。核基因组rDNA的ITS区进化速率较快，常被用于较低分类阶元，如属和种的分类。相对而言，18rRNAS和28SrDNA比ITS保守，适应于较高水平类群间的系统分析[30]。rDNA-ITS序列成为目前研究的热点，主要是由于全序列一般长度为500~800bp，通用引物可扩增rDNA基因；具有重复序列的多拷贝性，很容易从含量低或高度降解的DNA样品中得到扩增；在真菌形态不同的种间甚至同种的分离株间存在着高度变异等特点[31-33]。裴冬丽等[34]运用培养性状和形态特征综合分析的方法确定了河南省玉米穗粒腐病原主要是串珠镰刀菌，提取病原基因组DNA，对其内转录间区(ITS)序列进行PCR扩增和序列测定。结果鉴定出1个种为串珠镰刀菌，2个菌株rDNA间区ITS可变区属1型。1.2.2EF-1α延伸因子EF-1α在真核生物多肽链延伸过程中的作用已被基本阐明，其功能是结合氨酰tRNA，并在密码子配对的情况下将氨酰tRNA置于核糖体的A位点上[35]。它对镰刀菌系统发育学种的鉴定具有很大的可用性，首先它在镰刀菌种的水平上具有丰富的信息量；其次，在这个属的真菌内，并未发现不存在此基因序列的；最后，通用引物已被设计出，许多学者运用此基因位点成功鉴定镰刀菌[36-37]。李金花等[38]为明确甘肃马铃薯镰刀菌干腐病的优势病原，从张掖等6个县市采集表现有镰刀干腐病症状的马铃薯薯块，以组织分离法分离病原，单孢纯化后，共分离到293株镰刀菌菌株，其中以接骨木镰刀菌(F.sambucinum)和茄病镰刀菌(F.solani)出现频率高，是优势种。利用EF-1α基因引物对接骨木镰刀菌菌株(GAUF-F12)进行基因组DNA的PCR扩增，将PCR产物回收测序后在GenBank上比对，菌株GAUF-F12与CenBank登记的接骨木镰刀菌5个菌株的同源性均达99%；用DNASTAR分析软件将同源性较高的登记菌株的序列与CAUF-F12菌株构建同源性树，结果表明：该菌株与以上5个接骨木镰刀菌菌株均位于同源性树的同一分支聚为一类，与形态学的鉴定结果一致。

2营养体亲和群(VCG)技术的应用

真菌的营养体亲和性又称体细胞亲和性是指真菌菌株间菌丝能融合并交换细胞质或核物质的特性；根据营养体亲和性划分的群体称为营养体亲和群。营养体亲和群不仅能反映菌株之间的遗传相似性，而且有助于真菌繁殖方式及其群体遗传结构的分析。迄今，VCG技术已被广泛应用于曲霉属(Aspergillus)、立丝核菌属(Rhizoctonia)和镰刀菌(Fusarium)等20个属遗传研究，它能有效反应菌株之间的遗传相似性[39-40]。对于缺乏有性生殖的镰刀菌（如F.oxysporum）来说，不同的VCG可代表遗传分离的群体，同一VCG的菌株往往属于同一无性系[41]。Puhalla[42]首次将VCG技术应用到尖孢镰刀菌专化型的研究，鉴定出了16个VCG，并认为专化型与VCG之间有一定的对应关系，即同一VCG的菌株属于同一专化型，而不同专化型的菌株属于不同VCG。但需注意的是，在进行VCG研究时首先必须经过致病性测定，明确所测定的菌株是属于同个专化型或生理小种。据不完全统计，迄今VCG技术已应用于尖孢镰刀菌30多个专化型的遗传研究，不同专化型中VCG数目差别很大，反映了它们在遗传组成和结构上的差异。Zheng等[43]对巴西、埃及、佛罗里达、印度、以色列和南非的胶孢镰孢及其相似种进行分析，从中检测出7个VCG，其中埃及和佛罗里达的亲和组丰富，分别为3和4组。Lima等[44]对芒果畸形病的病原营养亲和性进行分析发现在埃及的芒果种植地区中检测到4个VCG，在巴西也发现6个。

3展望

1809年Link以粉红镰刀菌(F.roseumLink)为模式种建立了镰刀菌属。目前国际上存在10多种不同的形态学种分类系统，他们根据菌落的生长速度和颜色；小孢子的有无、形状、着生方式和瓶梗特点；大孢子的形态、顶细胞和基细胞的特征、隔膜数、长度和宽度；厚垣孢子的有无、着生位置；子座有无颜色和菌核的形成与否等为依据进行组和种的划分。由于镰刀菌是一个遗传多变的物种，其种间形态和生理上的差异非常大，且相关作用关系也十分复杂，加之传统分类学研究方法的局限性使得镰刀菌的分类学研究存在很大分歧，目前影响最大的是Booth(1971)和Nelson(1983)2个系统，其中Booth(1971)系统将镰刀菌划分为12组、33种和14个变种，Nelson(1983)系统包含12组33个种[45-46]。上述几种生物技术的介入，为镰刀菌的分类学及分类鉴定方法研究提供了分子水平的帮助，随机扩增多态DNA、内部简单重复序列等分子标记技术可用于分析菌株个体间及地理来源之间的相关性；rDNA-ITS、EF-1α延伸因子等主效位点基因序列分析为镰刀菌种、亚种等级的分类鉴定提供依据；对缺乏有性世代的镰刀菌，营养亲合群可区分不同遗传结构的群体。大量研究表明依靠分子标记和主效位点基因构建系统发育树，建立的系统学种与目前常用的2种形态学种系统既存在相关性，又存在一定的差异性，可能的原因是形态种的分类依据（如大小孢子的形成等）的变异性较大，对分类的结果存在一定的影响。因此，如何将镰刀菌在形态学种和系统学种上分类表现一致性，构建出一套完善的镰刀菌分类系统仍有待进一步研究，不过笔者也相信，随着科学技术的发展，建立一套完善的镰刀菌分类系统必将成为现实。