C18柱串联冠醚手性柱高效分离3种芳香族氨基酸对映体
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摘要将c18柱与手性冠醚柱串联，建立了一种反相高效液相色谱法用于3种芳香族氨基酸对映体同时拆分的方法。考察了反相色谱流动相的组成、pH值、柱温、流速对对映体拆分的影响。实验结果表明， 当流动相为HClO4乙腈溶液（86∶14， V/V， pH 2.0）、柱温20℃、流速0.4 mL/min时，3种氨基酸对映体可获得基线分离。进一步对比了C18柱、冠醚手性柱和串联顺序不同的4种分离模式，结果表明，C18柱不能拆分氨基酸对映体，仅能分离不同种类氨基酸； 冠醚手性柱可分离氨基酸映体，但不同种类氨基酸色谱峰出现重叠； 串联模式能实现3种氨基酸对映体的基线分离，实现双柱优势互补，而串联顺序对分离影响不大，仅影响色谱峰的峰形。
关键词手性分离； 芳香族氨基酸； 对映体； 冠醚柱
1引言
手性是自然界的基本属性，手性分子对映异构体因其结构的差异而具有不同的光学性能和生物活性[1～3]。氨基酸是蛋白质最基本的组成单元，大多数的氨基酸都存在手性中心，故在临床诊断和食品分析等领域均涉及氨基酸的手性分离与分析[4，5]。常见的α氨基酸大多是L构型，是人体重要的营养物质； 而如阿尔茨海默症等某些重要的生理疾病则与D构型的氨基酸的浓度变化息息相关[6]。芳香族氨基酸是指含有芳香环的氨基酸，包括苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸等[7]。在蛋白质化学和临床诊断与研究中，对芳香族氨基酸定量分析有着重要意义[8]。
手性化合物的拆分通常以正相色谱居多，可以获得较好的分离效果。然而，反相手性色谱具有毒性小、成本低的优点，并与实际样品具有更好的相容性。近年来，反相手性色谱固定相和反相手性色谱拆分都得到了快速发展[9]，出现了一些适用于含水样品中外消旋体分离的反相色谱分析方法[10～12]。然而，单一色谱柱常不能有效解决复杂样品的手性分离分析问题， 色谱柱串联技术的提出，使这一问题得到一定程度的解决[13]。
C18柱与手性柱进行串联，可同时发挥两类色谱柱的作用，有助于进一步提升色谱分离效能。目前，已有C18柱串联手性柱拆分外消旋体的报道。Sardella[14]等利用C18柱与奎宁手性柱串联，同时拆分了甲状腺素和三碘甲状腺氨酸对映体。Perera等[15]将C18柱分别与3种手性柱串联，对16种手性药物进行了拆分，手性化合物之间得到了较好分离，结果也表明手性柱和流动相的选择是影响串联分离的重要因素。目前还未见此串联技术用于手性氨基酸的分离。氨基酸的分离常需使用专用的氨基酸柱，对色谱分离条件有特定的要求，有时还需要柱前衍生[16]或使用手性添加剂[17]。本研究以3种芳香族氨基酸（结构如图1所示）外消旋体为拆分对象，建立了C18柱串联手性冠醚柱同时拆分多种氨基酸对映体的反相色谱方法，实现了多种氨基酸对映体的高效分离，也为多种手性化合物的同时分离提供了新思路。
2实验部分
2.1仪器与试剂
Dionex Ultimate 3000 高效液相色谱仪（美国戴安公司），配备DAD检测器、自动进样器； Innoval ASB C18色谱柱（50 mm × 4.6 mm， 5 μm，天津博纳艾杰尔科技有限公司）； CROWNPAK CRI（+）（150 mm × 3.0 mm， 5 μm，大赛璐药物手性技术上海有限公司）； PS20洁康超声波清洗机（东莞洁康超声波设备有限公司）。
苯丙氨酸（99%）、乙腈（北京百灵威科技有限公司）； 色氨酸（99%，阿拉丁试剂上海有限公司）； 酪氨酸（98%，_恩化学技术上海有限公司）； HClO4（分析纯，天津市鑫源化工有限公司）； 实验用水为纯净水。
2.2实验方法
准确称取适量的苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸外消旋体标准品，以流动相为溶剂，配制成50 mg/L的3种氨基酸混合标准溶液。将C18柱与CRI（+）柱串联，C18柱在前、手性冠醚柱在后，通过高效液相色谱进行手性拆分。流动相为HClO4乙腈溶液（pH 2.0），检测波长为200 nm，进样量为20 μL，拆分中分别对流动相的配比、pH值、流速和柱温进行优化，其中t1和t2分别为氨基酸两个对映体的保留时间， Rs为分离度。
3结果与讨论
3.1流动相比例对拆分的影响
流动相的种类对手性分离的影响最为重要。冠醚柱CROWNPAK CRI（+）在HClO4溶液和乙腈组成的流动相中对手性氨基酸具有较好的分离效果，并结合文献所采用的流动相[18，19]，以HClO4乙腈溶液（pH 1.5）为基础，通过改变流动相的比例，研究3种氨基酸混合物在串联柱上的手性分离效果，C18柱在前，手性冠醚柱CRI（+）在后，结果如表1所示。在所选条件下，3种氨基酸对映体均得到基线分离，酪氨酸最先被洗脱出来，色氨酸则保留时间最长； 随着流动相中乙腈比例的增多，对映体在两根色谱柱上的保留时间减少，分离度降低。兼顾3种氨基酸同时分离的分离度和分析效率，选择HClO4乙腈溶液（86∶14， V/V， pH 2.0）。
3.2HClO4溶液pH值对拆分的影响
流动相中pH值会影响分析物的存在形态，进而影响对映体在串联柱上的保留行为。分别调节HClO4溶液的pH值为1.5、2.0、2.5，HClO4溶液与乙腈的体积比为86∶14， 3种氨基酸对映体在3种不同pH值下的分离结果如图2所示。在使用pH 1.5和2.0的HClO4溶液为流动相时，所有的氨基酸对映体得到基线分离； 而HClO4溶液的pH 2.5时，3种氨基酸对映体出峰时间早且分离效果差，酪氨酸和苯丙氨酸两对对映体的4个色谱峰重叠在一起，在C18柱和手性柱上均没有被分离。结果表明：降低pH值可以得到更大程度的分离，氨基酸上的氨基在HClO4溶液中会被质子化，同时氨基酸的NH+4在手性联萘冠醚空腔内的作用增强，使得分析物在色谱柱上的保留时间增加。 进一步降低pH值时，各色谱峰的分离度增大，但出峰时间太长，综合考虑，选择流动相pH=2.0进行分离。
3.3柱温对拆分的影响
进一步考察串联柱的柱温对氨基酸对映体拆分的影响。结果如表2所示， 随着柱温的降低， 3种氨基酸对映体之间能获得更好的分离度，但在低温下，D酪氨酸和L苯丙氨酸的色谱峰逐渐重叠在一起，不利于3组氨基酸对映体的同时分离。因此，选择20℃为最优分离温度。
3.4流速对拆分的影响
适当增加流速可以缩短各对映体的出峰时间，提高效率； 但流速过高，使得分析物与固定相的作用不够充分，且不同手性化合物之间的色谱峰更加接近，分离效率降低。不同流速对3对氨基酸对映体在串联柱上的拆分情况的影响如表3所示。随流速增加分离度降低，但保留时间缩短，兼顾分离度和分析效率，选择流速为0.4 mL/min。
3.5串联模式对拆分的影响
C18柱串联冠醚手性柱分离3种氨基酸外消旋体，分离效果同时受C18柱和手性柱的影响，其中，起决定性因素的还是手性柱，一方面可以将3种外消旋体适度分离，另一方面可以将对映体进一步分离； 而C18柱则实现3种外消旋体更充分的分离，这样给手性柱拆分对映体时提供了更多的时间和空间。
进一步考察色谱柱串联模式对氨基酸对映体拆分的影响，
分别采用C18柱在前冠醚柱在后和冠醚柱在前C18柱在后的串联模式进行分离，并与单独使用C18柱分离和单独使用冠醚柱分离进行对照。如图3所示，单独使用冠醚柱仅能部分拆分对映体，色谱峰重叠十分严重，色谱峰之间的空间过于狭小； 单独使用C18柱时，不能拆分对映体，但3种氨基酸外消旋体能很好地分离，有足够的空间距离； C18柱串联冠醚柱或冠醚柱串联C18柱，都能很好地实现3种氨基酸外消旋体的分离，说明串联模式分离多种手性化合物实现了双柱优势互补，取得了满意的分离效果。此外，从图3还可见，串联的先后顺序对分离无明显影响，谱图基本一致，但C18在后时，峰形对称性略差，这是由于氨基酸在C18柱上分离略有拖尾； 反之，当C18在前时，能够得到更好的峰形，这是由于后面的手性柱分离能够一定程度改善峰形。因此，采用C18柱串联冠醚柱分离效果更佳。
实验， C18柱串联手性柱的反相色谱拆分方法，容易实现多种对映体的基线分离，也为多种手性化合物的同时分离提供了新思路。
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AbstractA reversed phase high performance liquid chromatographic （RPHPLC） method was proposed by using C18 column tandem crown ether chiral column for simultaneous separation of three kinds of aromatic amino acid enantiomers. The chromatographic conditions， including mobile phase proportion， pH， column temperature and flow rate， were optimized. The experimental results showed that the three aromatic amino acid enantiomers could be successfully separated under the optimal conditions such as perchloric acid solutionacetonitrile （86∶14， V/V， pH=2） as mobile phase， column temperature of 20℃ and flow rate of 0.4 mL/min. The separation under four HPLC column connection modes was further investigated. The results revealed that different kinds of amino acids could be separated on C18 column， but not for amino acid enantiomers； amino acid enantiomers could be separated on crown ether chiral column， but the chromatographic peaks of each amino acid enantiomers overlapped seriously； baseline separation of three amino acid enantiomers could be obtained under the connection of two columns， but the separation under different column connection sequence almost had no difference except the peak shape.
KeywordsChiral separation； Aromatic amino acids； Enantiomers； Crown ether column