甘薯WRKY基因家族序列的分离与鉴定
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摘要：根据WRKY基因家族序列的保守区域设计简并引物，从甘薯（Ipomoea batatas L.）品种徐薯18中扩增出wrky基因家族，经克隆、测序后得到15条WRKY基因家族序列，其编码的氨基酸序列包含有WRKY基因家族所具有保守的WRKYGQ和TTYEGKH（T/N/S/G/A/D）（H/Q）区。对甘薯WRKY基因家族氨基酸序列与部分植物WRKY基因家族氨基酸序列进行聚类分析，发现其聚为5类，相似性较高，推测各类中相似性较高的序列分别属于同一个基因家族。
关键词：甘薯（Ipomoea batatas L.）；WRKY基因家族；简并引物；分离；鉴定
中图分类号：S531 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）17-4241-04
Isolation and Identification of WRKY Gene Family from Sweet Potato
WANG Lian-jun，LEI Jian，SU Wen-jin，YANG Xin-sun
（Institute of Food Corps， Hubei Academy of Agricultural Sciences， Wuhan 430064， China）
Abstract：The degenerate primers designed from the conserved motifs in the WRKY gene family were used to amplify WRKY gene family from Ipomoea batatas， Xushu18. 15 WRKY gene family were obtained according to cloning and sequencing， and the amino acid sequence contained WRKYGQ and TTYEGKH（T/N/S/G/A/D）（H/Q） motifs of the WRKY. Cluster analysis of the predicted amino acid sequences grouped the WRKY of Ipomoea batatas and the known WRKY in NCBI database into five classes， and the sequence similarity was high. It was deduced that the RGAs with high similarity belonged to one gene family.
Key words： sweet potato（Ipomoea batatas L.）； WRKY gene family； degenerate primers；isolation；identification
收稿日期：2013-07-16
基金项目：公益性科技研究项目（2012DBA53001）；国家现代甘薯产业技术体系建设项目（CARS-11-C-15）；湖北省农业科技创新中心资助项目
（2007-620-001-03）；湖北省农业科学院青年基金项目；湖北省农业科学院特色学科项目
作者简介：王连军（1982-），男，河南新乡人，助理研究员，博士，研究方向为植物遗传育种，（电话）15377503092（电子信箱）；
通讯作者，杨新笋，男，研究员，主要从事甘薯育种与栽培研究工作，（电子信箱）。
甘薯（Ipomoea batatas L.）是世界上重要的粮食、饲料、工业原料及新型能源用块根作物。中国是世界上最大的甘薯生产国，常年种植面积550万hm2，鲜薯产量约1.2×108 t，分别占世界甘薯种植总面积和总产量的60%和85%[1]。甘薯在遗传上高度杂合，种内、种间杂交不亲和、遗传资源匮乏，遗传基础狭窄以及病虫害、病毒病危害严重，严重制约了甘薯品种的遗传改良[2]。近年来，许多研究表明通过基因工程手段能够改善甘薯的抗病和抗逆能力[3-6]。WRKY转录因子是近年来在植物中发现的一类锌指型转录因子基因家族，其序列的N-端含有高度保守的WRKYGQ氨基酸序列。WRKY转录因子能够与C/TTGACC/T序列（W-box）发生特异性结合，从而调节基因的表达[7]。WRKY转录因子广泛参与植物对生物和非生物胁迫应答反应，包括对根结线虫、真菌、病毒、NaCl、PEG、低温、高温、机械刺激以及低磷等逆境胁迫因子的响应[8-20]。另外，也有研究表明WRKY基因家族参与激素的信号转导过程，如白菜型油菜中的WRKY基因受ABA诱导[21]。
本研究基于WRKY转录因子的保守区域设计简并引物，PCR扩增获得15条甘薯WRKY类转录因子基因片段，均含有WRKY转录因子的保守结构域，然后将其导入甘薯栽培种中，为提高甘薯抗病抗逆性奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
试验材料为高抗根腐病甘薯品种徐薯18[22]，种植于湖北省农业科学院粮食作物研究所，采集新鲜幼嫩叶片用于植物基因组DNA的提取。
1.2 方法
1.2.1 甘薯WRKY基因家族序列的PCR扩增 用新型植物基因组DNA提取试剂盒提取甘薯品种徐薯18的基因组DNA。根据WRKY基因家族的氨基酸保守结构域WRKYGQ和TTYEGKH（T/N/S/G/A/D）（H/Q）设计简并引物[23-25]。
PCR反应体系为：10×PCR Buffer（含Mg2+）5 μL，dNTPs（10 mmol/L） 4 μL，上、下游引物各1.0 μL，基因组 DNA（50 ng/μL） 1 μL，EASY-Taq DNA Polymerase 0.5 μL，ddH2O补至总体积为25 μL。PCR反应在TP-600型梯度PCR仪上进行，反应程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，42 ℃退火45 s，72 ℃延伸150 s，39个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物以2.5%琼脂糖凝胶电泳检测，紫外灯下观察并拍照。
1.2.2 甘薯WRKY基因家族序列的克隆与序列分析 使用普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收扩增得到的目的片段，连接pMD19-T载体，转化入大肠杆菌感受态细胞，进行目标片段的克隆，操作按照试剂盒说明进行。将阳性克隆送至上海英骏生物技术有限公司进行测序，在NCBI数据库（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）中进行BLAST同源性比对，采用DNAMAN软件对获得的序列和数据库中已知物种WRKY基因家族基因编码的氨基酸序列进行分析，构建系统发育树。
2 结果与分析
2.1 甘薯WRKY基因家族序列的扩增
利用简并引物从甘薯品种徐薯18基因组DNA中扩增获得集中于750 bp的弥散条带（图1）。为进一步分析扩增产物，对弥散条带进行了回收和克隆，共得到50个阳性克隆。
2.2 甘薯WRKY基因家族核苷酸序列的比对分析
BLAST同源性比对结果表明，有15个片段与NCBI中已登录的植物抗病基因及同源序列具有一定的同源性，可见利用简并引物进行同源扩增是分离甘薯WRKY基因家族序列的有效方法。有2个区域相对保守，前面一段区域为45个碱基，后面一段区域为110个碱基，PCR扩增使用模板为基因组DNA，推测中间序列为内含子序列（图2）。序列Ib241在后面一段区域多出了一个碱基T，由于该碱基的插入造成这一位置之后的一系列编码发生移位错误，其结果是在插入碱基T之后开始合成和正常完全不同的氨基酸序列（图2，星号标注出差异）。
2.3 甘薯WRKY基因家族氨基酸序列的比对分析
利用DNAMAN软件将剩余的15条序列中间的内含子序列去除，推导演绎出氨基酸序列，所有的序列长度均为155个碱基，编码51个氨基酸。推导的氨基酸序列均具有WRKYGQ和TTYEGKH（T/N/S/G/A/D）（H/Q）保守结构域（图3），这是WRKY转录因子共有的特征序列，据此可确定这15条序列均为WRKY基因家族序列。将扩增得到的WRKY基因家族序列和数据库中检索到的8条已知物种的WRKY基因家族序列进行同源性比对，构建系统发育树（图4）。
由图4可知，这些序列聚成5大类，第Ⅰ类为Ib26、Ib156和Ib247；第Ⅱ类为Ib16、Ib41、Ib148、Ib162、Ib174、GmWRKY35（大豆，Glycine max）、PmWRKY112（白松，Pinus monticola）、VvWRKY20（葡萄，Vitis vinifera）、 Ib184和Ib246；第Ⅲ类为Ib172、Ib-188和Ib-245、NtWRKY4（烟草，Nicotiana tabacum）、；Ibspf1、NbWRKY8（本生烟，Nicotiana benthamiana）；第Ⅳ类为NbWRKY2（本生烟）；第Ⅴ类为Ib-141、Ib-182和DIWRKY29-2。
3 讨论
植物具有复杂的基因表达调控体系抵御病原物的侵染，并且主要通过转录水平上的调控来实现，WRKY转录因子家族在调控基因的表达和对外界环境生物和非生物胁迫的反应中起着重要作用[8]。WRKY转系因子在调控与植物防御反应相关基因的表达上起着非常重要的作用。许多防御相关的基因，如PR、NPR1基因，启动子区域都包含W-box[24]。本研究试验材料为甘薯品种徐薯18，其高产稳产、适应性广、综合性状好，具有高抗根腐病的特性[22]。WRKY转录因子序列的获得将有助于揭示其高抗根腐病的机理。
内含子是断裂基因中的非编码区序列，其中，真核基因前体mRNA的内含子是最常见的内含子，在mRNA转录加工后被切除掉，起初人们认为内含子没有功能。但近年来的许多研究发现，有些真核基因的内含子在基因表达中具有相当重要的作用，甚至有些基因的表达需要内含子参与[25，26]。本研究发现所有15条WRKY基因家族序列具有长度不同的内含子，这些长度不同的内含子存在可能调控着该家族基因的表达。
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