软脉煎对实验性晚期动脉粥样硬化家兔平滑肌细胞凋亡的调控作用

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摘 要：目的：通过对颈动脉粥样硬化家兔模型的治疗观察,研究软脉煎对动脉粥样硬化形成晚期血管平滑肌细胞Bcl-2、Bax及Caspase-8表达的影响。方法：采用高脂喂养加颈动脉内膜空气干燥术制备家兔颈动脉粥样硬化模型，38只新西兰家兔随机分成4组，正常对照组8只，模型组8只，软脉煎组11只，辛伐他汀组11只，12周后采用免疫组织化学法检测Bcl-2、Bax、Caspase-8的表达。结果：软脉煎组与模型组比较，能升高Bcl-2蛋白水平，降低Bax、Caspase-8蛋白表达，从而升高Bcl-2/Bax比值，具有显著性意义（P

关键词：软脉煎；动脉粥样硬化；细胞凋亡；Bcl-2；Bax；Caspase-8

中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1673-7717(2012)01-0093-03

Control Effects of Ruanmai Decoction on Apoptosis of Rabbit's Smooth Muscle Cell

in Experimental Advanced Atherosclerosis

PAN Luqian,GU Yun

(Longhua Hospital Shanghai University of Traditional Chinese Medicine,Shanghai 200032,China)

Abstract:Objective：To explore the effects of Ruanmai Decoction on expressing Bcl-2, Bax and Caspase-8 of vascular smooth muscle cell in experimental advanced atherosclerosis by observing the carotid atherosclerotic rabbit models.Methods：The carotid atherosclerotic rabbit models were induced by high-cholesterol-diet plus air-drying. Thirty-eight New Zealand rabbits were randomly divided into four groups, the normal control group (n=8), the model group (n=8), the Ruanmai Decoction group (n=8) and the simvastatin group (n=11). The expressive level of Bcl-2, Bax and Caspase-8 were assayed by the method of immunohistochemistry after twelve-week treatment.Results：Compared with the model group, the treatment of Ruanmai Decoction could raise the levels of Bcl-2 protein but reduce the level of Bax and Caspase-8 protein, therefore the Bcl-2/Bax ratio increased. There's significant difference among groups (P

Key words:Ruanmai Decoction; Apoptosis; Atherosclerosis; Bcl-2；Bax；Caspase-8

动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是临床常见病、多发病，是冠心病、脑血管意外等疾病的共同病理基础，严重威胁人类的身体健康，是人类死亡的第一号杀手[1]，防治AS成为医学界共同关注的重要课题。AS的病因和发病机理十分复杂，近年来细胞凋亡在AS形成和发展中的作用逐渐成为研究的热点。中医典籍中无AS的病名，常将其归属为痰证、瘀证、脉痹等范畴[2]，治疗上也多从活血化瘀、健脾化痰等方法着手。而本研究采用具有补肾益气作用的中药复方软脉煎治疗AS模型家兔，以观察其对AS形成晚期血管平滑肌细胞凋亡信号途径中Bcl-2、Bax及Caspase-8表达的影响，现报道如下。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1动物将健康新西兰家兔（购自上海宝牧实验动物养殖场，许可证号scxk沪2004-0007）38只（雄性，4月龄，体重2.0～2.5kg）随机分为4组：正常对照组8只，模型组8只，软脉煎组11只，辛伐他汀组11只。

1.1.2药物与试剂软脉煎：药材由上海中医药大学附属龙华医药中药房提供。辛可（辛伐他汀分散片）：由广州南新制药有限公司生产，20mg/片（国药准字H20010750，生产批号SST01507）。胆固醇：由上海源聚生物科技有限公司提供（批号070829）。B细胞淋巴瘤/白血病-2多克隆抗体，Bax多克隆抗体，基质金属蛋白酶-2多克隆抗体，半胱氨酸蛋白酶-8多克隆抗体均购自Santa Cruz Biotechnology公司。

1.2方法

1.2.1家兔AS模型制备 高脂喂养加颈动脉内膜空气干燥术。

①高脂饲料喂养：2%胆固醇、2%猪油、96%家兔普通颗粒饲料，混匀后压制成高脂饲料。

②空气干燥术：在严格无菌条件下，动物经3%戊巴比妥钠30mg/kg静脉麻醉，颈部脱毛，于甲状软骨上方水平分离右侧颈总动脉，长约2.5cm，两端以动脉夹阻断血流，4号头皮针穿刺进入阻断血流的血管两端，生理盐水冲洗置换出管腔内的血液后，按上已调节好流量为250mL/min的气流，历时5min，造成内皮干燥，然后管腔内充满生理盐水，放开临时动脉夹恢复血流。压迫止血，待颈总动脉完全止血且血流通畅后缝合皮肤。术后每只给予青霉素钠肌注（按照成人等效剂量换算），连续3天。

1.2.2给药方法与疗程正常对照组：每日进食普通颗粒饲料150g，自由饮水，喂养1周后灌服双蒸水5mL/（kg•d），连续灌胃11周；其余组：每日进食高脂饲料150g，自由饮水，1周后实施右颈动脉内膜空气干燥术，术后继续高脂喂养。模型组同时灌服双蒸水5mL/（kg•d），软脉煎组灌服软脉煎35.3g/（kg•d），辛伐他汀组灌服辛伐他汀0.77g/（kg•d）。连续灌胃11周。最后，经耳缘静脉注射空气10～20mL处死家兔，取右侧颈总动脉，放入10%中尔马林中固定，送免疫组化检测。

1.2.3 免疫组织化学检测右颈总动脉Bcl-2、Bax、Caspase-8的表达石蜡包埋，伊红染液。滴加适当稀释一抗，4℃下18h； 0.04%DAB+0.03% H2O2显色8min；水洗，苏木素衬染30s，水洗，盐酸乙醇蓝化2s，水洗，微波蓝化，常规树脂封片；显微镜下观察，阳性为棕黄色或棕褐色，并呈颗粒状，背景呈紫蓝色。图象扫描分析免疫组化染色阳性面积。

1.3统计学处理

实验数据采用SPSS 15.0 for Windows 统计软件包进行数据统计，其中各组均采用（±s）表示，统计显著性水平为P

2结 果

2.1软脉煎对右颈动脉平滑肌细胞Bcl-2、Bax蛋白表达的影响

见表1。模型组Bax蛋白表达、Bcl-2/Bax值均较正常对照组显著升高（P

2.2软脉煎对右颈动脉平滑肌细胞Caspase-8蛋白表达的影响

见表2。模型组、软脉煎组Caspase-8蛋白表达都有不同程度升高，仅模型组与正常对照组相比有显著性差异（P0.05）。两治疗组Caspase-8阳性面积较模型组相比，均有不同程度降低，差异有统计学意义（P0.05）。

3讨 论

近年研究认为，细胞凋亡可能是动脉粥样硬化病变中细胞死亡的主要方式，平滑肌细胞凋亡失调和凋亡小体清除不足可能是加剧As发展的重要因素。纤维帽中细胞凋亡增加可降低斑块稳定性而致急性临件发生[3]。细胞凋亡是一系列基因活动引起的级联反应的结果。由诱导基因和抑制基因共同调控。Bcl-2具有抗细胞凋亡功能，能通过抵抗多种形式的细胞凋亡延长细胞寿命。Bax是Bcl-2的同源基因，其过度表达可拮抗Bcl-2的保护效应使细胞趋于凋亡[4]。Bax和Bcl-2通过形成同源或异源二聚体来调节细胞凋亡。当Bax形成同源二聚体时诱导细胞凋亡；Bax与Bcl-2形成异源二聚体时则实现了Bcl-2抑制细胞凋亡的功能[5]。Bcl-2与Bax蛋白量的比率决定异二聚体（Bcl2/Bax）与同二聚体（Bax/Bax）的比值，这对决定细胞凋亡的易感性起关键作用。当一细胞系的所有细胞内异二聚（Bcl-2/Bax）的含量≥50％ 时，则细胞耐受凋亡。而当细胞内Bax同二聚体>80％ 时且在适当信号诱导下则细胞出现凋亡。

本实验发现软脉煎组Bax蛋白表达、Bcl-2/Bax值均显著低于模型组，Bcl-2表达量显著高于模型组。故推测软脉煎的作用机制可能是通过Bax/Bcl-2异源二聚体与Bax-Bax同源二聚体竞争Bax，减少诱导凋亡的同源二聚体的形成，表明软脉煎可以从蛋白水平调节血管平滑肌细胞凋亡，在动脉粥样硬化的形成晚期，通过降低斑块肩部及纤维帽处的凋亡率，以提高斑块的稳定性，减少心脑血管事件的发生。

凋亡能在信号途径的许多点被打断，可从抑制或防止刺激因素以及抑制凋亡途径防止细胞凋亡。抑制凋亡的方法决定于阻断细胞凋亡级联环节中的关键步骤，如果凋亡是多途径的，阻断某一途径并不一定能抑制凋亡，因为还可经其他途径引起凋亡。针对多信号途径的介质可能是抑制凋亡的较好的靶标。从细胞凋亡的内外两条信号途径我们可以看出Caspase-8是细胞凋亡信号途径中的关键步骤，同时涉及两条信号通路，并且是针对多信号途径的上游介质[6-7]，因此我们将Caspase-8作为我们本项研究的靶标。

本实验观察到软脉煎组Caspase-8蛋白表达显著低于模型组，提示软脉煎能通过干预细胞凋亡信号途径中的多信号途径介质Caspase-8来抑制凋亡，从而降低动脉粥样硬化晚期粥样斑块的凋亡，以增强粥样斑块的稳定性，防止心脑血管意外的发生。

以往动脉粥样硬化的中医研究，基本上把AS归属于“血瘀”、“痰浊”范畴，在治疗上多集中于消除“痰”、“瘀”，而笔者认为AS与肾气亏虚有关，肾虚与痰瘀有着因果的联系。动脉粥样硬化病位在血脉，为心所主，其本在肾。心主血脉，肾主藏精，心肾之间不仅精血同源互补，而且有着经脉、水火的联系，两脏上下协调，功能相助。心主血脉的功能正常发挥需要肾气的推动，肾精化血充脉等，正如《内经》所云“心之合脉也，其茶色也，其主肾也。” 动脉粥样硬化的病理基础是痰和瘀。痰、瘀为病之标，其本在脏腑的功能失调，气血津液运行、代谢发生障碍，与肾有密切的关系。肾阴不足，虚火内生，灼津炼液，而成痰浊。正如《医林改错》所谓：“元气既虚，必不能达于血管，血管无气，必停留而瘀。”痰浊壅阻脉道，痰借血体，血借痰凝，滞而为瘀，胶结血脉，心气营运不畅，遂成粥样斑块。且AS多见于40岁以后，中年向老，肾元亏虚，精气渐衰，髓海渐空，脏腑功能也随之衰弱，可见AS多发生于人体肾气开始亏虚的时候。故补气须补元气，主要是肾中精气。软脉煎全方配伍，补肾益气，阴阳共济，共奏精气同补之功。我们的研究表明，具有补肾益气作用的软脉煎在AS形成的晚期能减少血管平滑肌细胞的凋亡，维持斑块的稳定性。进一步证实AS的病因病机为痰瘀是标，肾虚精血不足是本。提示我们从中医“治病必求于本”的理论出发，以补虚为主进行治疗这一方法，具有一定的科学性。

参考文献

［1］ 赵明中.全球性动脉粥样硬化血栓病人健康调查启动――REACH调查研究以及提高居全球致死率榜首的动脉粥样硬化血栓疾病的认识［J］.中国医药导刊，2004，6（3）:234.

[2]周杰，钱振准. 中医药防治动脉粥样硬化研究进展[J]. 安徽中医学院学报，1998，17（3）：60.

[3]覃军，何作云. 管状动脉粥样硬化斑块破裂的细胞与分子生物学研究进展［J］. 中国动脉硬化杂志，2000，8（1）：79-81.

[4]Lebovitz HE．Clinician's manual on instlin resistance[M]．London；Science Press Ltd，2002：16-18.

[5]Kockx MW,De Meyer GR,Muhring J,et al.Apoptosis and related proteins in different stages of human atherosclerotic plaques［J］. Circulation, 1998,97(23):2307-2315.

[6]Chang D W , Xing Z , Capacio V L , et al. Interdimer processing mechanism of procapase-8 activation [J] . EMBOJ, 2003, 22(16):4132-4142.

[7]Stennicke H R , Jurgensmeier J M , Shin H , et al . Procaspase-3 is a major physiologic target of caspase-8[J]. J Biol chem, 1998,273(42):27084-27090.