生物标志物、CT评价咳嗽变异性哮喘气道重塑的研究
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[摘要] 目的 探讨诱导痰神经生长因子（NGF）、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）及高分辨CT在评价咳嗽变异性哮喘（CVA）患者气道重塑中的作用。 方法 将50例确诊为CVA的患者设为CVA组，20例健康体检者设为正常对照组（N组），受试者行肺通气功能、诱导痰及胸部高分辨CT（HRCT）检查，应用酶联免疫吸附法（ELISA）检测诱导痰中NGF、MMP-9浓度，计算气道壁的厚度（T）、气道壁面积（WA）、气道壁面积占气道总截面积的百分比（WA%），并应用体表面积（BSA）对T、WA进行校正。 结果 与N组比较，CVA组诱导痰NGF、MMP-9浓度升高，差异有统计学意义（P < 0.05）。CVA组与N组相比，肺通气功能（FEV1、FVC、MMEF）差异无统计学意义（P > 0.05）。CVA组T/BSA、WA/BSA、WA%测定值与N组相比，差异有统计学意（P < 0.05）。CVA咳嗽患者诱导痰NGF浓度与WA/BSA、WA%和T/√BSA呈正相关（r = 1.103、0.846、0.917，均P < 0.05）；诱导痰MMP-9浓度与WA/BSA、WA%和T/√BSA呈正相关（r = 0.742、1.020、0.694，均P < 0.05）。 结论 诱导痰NGF、MMP-9可作为评价CVA气道重塑的生物标志物，HRct检查可作为无创手段更广泛用于气道重塑的评估。联合生物标志物及高分辨CT可更全面评价CVA患者气道重塑情况，从而更好地指导临床治疗。
[关键词] 咳嗽变异性哮喘；气道重塑；神经生长因子；基质金属蛋白酶-9；高分辨CT
[中图分类号] R562.2+5 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2013）06（c）-0015-03
Research on the assessment of airway remodeling in cough variant asthma by use of biological markers and CT
ZHONG Xueying HUANG Yanming WEN Yuting
Department of Respiratory Medicine，Jiangmen Central Hospital of Guangdong Province，Jiangmen 529030， China
[Abstract] Objective To explore the roles of biological markers of nerve growth factor （NGF）， matrix metalloproteinase-9（MMP-9） in induced sputum and high-resolution CT （HRCT） in assessing airway remodelillg in cough variant asthma（CVA）. Methods Fifty cases of CVA patients were recruited as CVA group， and control group （N group） included 20 healthy persons in this study. Lung function test， induced sputum and HRCT check were performed on these subjects. The concentrations of NGF， MMP-9 in induced sputum were measured by ELISA. The wall thickness（T）， the airway wall area （WA） and the percentage of airway wall area to total airway cross sectional area（WA%） were calculated on HRCT. T and WA were adjusted by body surface area（BSA）. Results The concentration of NGF， MMP-9 in induced sputum of CVA group were higher than those of N group （P < 0.05）. The lung function parameters （FEV1， FVC， MMEF） of CVA group and N group had no difference （P > 0.05）. WA/BSA， WA% and T/√BSA of CVA group were higher than N group （P < 0.05）. The concentration of NGF in induced sputum of CVA group showed positive correlation with WA/BSA， WA% and T/√BSA（r = 1.103， 0.846， 0.917， P < 0.05）. The concentration of MMP-9 in induced sputum of CVA group showed positive correlation with WA/BSA， WA% and T/√BSA（r = 0.742， 1.020， 0.694， P < 0.05）. Conclusion NGF and MMP-9 in induced sputum can be used as the biological makers in assessing airway remodelillg in CVA. The airway remodeling could be assessed by HRCT which is noninvasive and can be used more generally. It will be better to assess the airway remodeling of CVA patients by the combination of biological makers and HRCT， thus guided the clinical treatment.
[Key words] Cough variant asthma； Airway remodeling； Nerve growth factor； Matrix metalloproteinase-9； High resolution computed tomography
咳嗽变异性哮喘（cough variant asthma，CVA）是一种特殊类型的支气管哮喘，咳嗽是其唯一或主要临床表现，无明显气促、喘息。研究表明CVA也具有典型哮喘的病理生理过程，包括气道嗜酸粒细胞炎症、气道高反应性，甚至气道重塑[1]。因气道重塑最终可导致气道壁结构和功能的改变，因此，有效监测CVA患者的气道重塑情况，对评价、指导治疗及判断预后均有重要意义。本研究拟探讨生物标志物神经生长因子（NGF）、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）及高分辨CT（HRCT）在CVA气道重塑评价中的作用。
1 资料与方法
1.1 一般资料
收集本院2010～2012年确诊为CVA的患者50例，设为CVA组，其中，男29例，女21例，年龄22～66岁，平均（44.36±16.74）岁。入选标准：年龄≥18岁，咳嗽时间>8周，符合我国《咳嗽的诊断与治疗指南》中CVA的诊断标准[2]。排除标准：①伴有胸闷、喘息、气促等症状，肺部听诊可闻及哮鸣音；②吸烟者；③合并其他肺部疾病者。正常对照组（N组）来自本院体检的健康成人20例，其中，男12例，女8例，年龄21～62岁，平均（41.65±14.73）岁，无吸烟史，近8周无呼吸道感染。
1.2 方法
1.2.1 诱导痰处理的方法 超声雾化吸入3%高渗盐水15～20 min，咳痰至培养皿，向痰液内加入4位体积的0.1%的二硫苏糖醇，涡旋震荡10 min，再加用等量的磷酸盐缓冲液震荡5 min，2000 r/min离心10 min，取其上清液-80℃冻存待测量。
1.2.2 诱导痰上清液相关因子的检测 诱导痰上清液在室温下解冻，采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测诱导痰上清液中NGF、MMP-9的浓度。
1.2.3 肺通气功能的检测 采用麦迪肺功能仪测定用力肺活量（FVC），第1秒最大呼气量（FEV1），用力呼气中段流速（MMEF）。
1.2.4 胸部HRCT的检查 所有受试者均行HRCT检查。应用TOSHIBA Aquilion 64层螺旋CT机，从肺尖到肺底以层厚为1 mm，层距10 mm扫描，扫描条件140 kV，200 mAs，矩阵512×512，在吸气末憋气连续扫描HRCT片，采用骨算法进行重建。采用窗宽1500 Hu，窗位-450 Hu。由2名不知道受试者临床资料的专科医师于隆突及右侧横膈上2个部位选择能清晰显示的气道，测量气道腔外径（D）和管腔内径（L）、气道腔面积（AI）、气道总横截面积（AO），通过计算机程序计算气道壁的厚度（T）[T=（D-L）/2]、气道壁面积（WA）（WA=AO-AI），气道壁面积占气道总横截面积的百分比（WA%）[WA%=（AO-AI）/AO]。每人独立测量2次，取其平均值。因气道大小可能受体型的影响，因此应用体表面积（BSA）对T、WA进行校正。气道壁厚度根据WA/BSA、WA%和T/√BSA估算。
1.3 统计学处理
应用SPSS 13.0统计软件进行统计分析，所有数据以均数±标准差（x±s）表示，采用t检验、Pearson相关分析处理相关数据，以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 诱导痰NGF、MMP-9检测的结果
与N组比较，CVA组诱导痰NGF、MMP-9浓度升高，差异有统计学意义（P < 0.05）（表1）。
表1 两组诱导痰上清液NGF、MMP-9检测的结果（x±s）
注：与N组比较，aP < 0.05
2.2 肺通气功能检测的结果
CVA组与N组比较，肺通气功能（FEV1、FVC、MMEF）的差异无统计学意义（P > 0.05）（表2）。
2.3 胸部HRCT检测的结果
CVA组WA/BSA、WA%和T/√BSA测定值与N组相比，差异有统计学意（P < 0.05）（表3）。
2.4 CVA患者诱导痰NGF、MMP-9与WA/BSA、WA%和T/√BSA的相关分析
CVA咳嗽患者诱导痰NGF浓度与WA/BSA、WA%和T/√BSA呈正相关（r = 1.103、0.846、0.917，均P < 0.05）；诱导痰MMP-9浓度与WA/BSA、WA%和T/√BSA呈正相关（r = 0.742、1.020、0.694，均P < 0.05）。
3 讨论
气道重塑最早是由Huber和Koessler于1922年提出的，其定义为气道细胞成分、结构、数量和细胞外组分的改变[3]。病理研究发现CVA患者同样存在气道重塑，主要表现为基底膜下层增厚、血管大小及杯状细胞面积增加、血管增生[4]。
目前临床上诊断和评价气道重塑存在一定困难，较常用的方法是肺功能测定及纤维支气管镜下支气管黏膜活检。本研究发现，CVA患者通气功能与N组相比差异无统计学意义（P > 0.05），对于早期发现CVA气道重塑的作用可能不大。而支气管镜活检测量支气管壁的厚度为有创检查，不适宜反复测定，且活检结果常因平滑肌的增厚而产生干扰，令其临床应用受限。近年来国外较多学者研究运用HRCT来观察支气管哮喘患者气道面积、气道壁厚度改变从而评价其气道重塑情况，目前国内这方面的研究较少。HRCT影像技术可测量各级气道壁的增厚，是比支气管黏膜活检更简单的无创检查方法，在两者的相关性方面，已有学者做了评估。Kasahara 等[5]测量了49例典型哮喘患者和18名健康人支气管活检标本的网状层厚度，并用HRCT测定气道壁厚度，结果表明HRCT显示气道壁增厚的变化与支气管活检的基底膜增厚有很好的相关性，因此本研究也应用HRCT评估CVA的气道重塑情况。鉴于测定参数及测量部位不同等可能影响测定结果，本研究借鉴以往国外的相关研究资料[6]，选取显示较清晰的隆突和右侧横膈上进行测量，并用BSA进行校正，以避免体型的影响而导致测量误差。本研究发现，CVA组上述2个部位的WA/BSA、WA%和T/√BSA测定值与N组相比，差异有统计学意义，提示CVA患者同样存在气道重塑，HRCT可对其进行定量分析。由于HRCT无创，且具有极好的空间分辨率，能清晰地显示肺组织的细微结构，几乎达到能显示与大体标本相似的形态学改变，可发现气道重塑的部位、严重程度，并进行定量分析，在CVA气道重塑的评估及治疗监测中具有重要的临床价值，但其测量部位及测定参数、CT图像参数等尚需进一步探讨以制订统一的标准。
近年研究表明生长因子、细胞因子、炎症介质和酶等多种因素参与气道重塑，其中MMP-9、NGF均对哮喘所致的气道重塑发挥重要作用。
MMP-9是基质金属蛋白酶家族的重要成员，TIMP-1是MMP-9的生理性特异性抑制剂，生理情况下，它以1∶1的分子比例与MMP-9结合，特异性抑制MMP-9的活性[7]。研究证实哮喘患者的痰及支气管肺泡灌洗液中MMP-9的表达明显增高，并推测MMP-9的过量表达可引起气道炎症，进而引起气道重塑[8]。本研究也发现，CVA患者与典型哮喘患者存在类似改变，其诱导痰MMP-9浓度升高，并与气道壁增厚指标WA/BSA、WA%和T/√BSA呈正相关，表明其参与CVA气道重塑进程。其机制可能如下：①气道重塑过程也是细胞外基质重塑的过程，MMP-9是降解细胞外基质的最主要蛋白酶。病理状态下，MMP-9过度表达，造成MMP-9/TIMP-1失衡，细胞外基质的降解和沉积发生紊乱[7]，导致基底膜下层增厚。②MMP-9可促进气道纤维化并活化潜在的结合性生长因子，引起平滑肌增殖参与气道重塑[9]。③MMP-9可参与血管内皮生长因子的释放而促进新血管形成[10]。④MMP-9还可促进成纤维细胞的增生并刺激其生成胶原，从而促进气道纤维化。已有动物实验证实地塞米松通过抑制肺内MMP-9/TIMP-1的表达可以减轻气道重塑[11]。
NGF是一种影响神经细胞生长、发育和存活的多功能神经营养因子。近期研究表明，与支气管哮喘气道重塑关系密切的支气管上皮细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞、平滑肌细胞均可表达NGF，且自身有NGF受体[12]。NGF可能启动或增强上述细胞的生物学效应，引起支气管哮喘气道重塑发生。上皮下纤维化和气道平滑肌的增殖肥大是哮喘气道重塑的突出表现。Freund-Michel等[13]报道NGF可引起人气道平滑肌增殖。同时NGF还可诱导肺成纤维细胞迁移及分化成肌成纤维细胞，并诱导其产生胶原[14]，从而导致上皮下纤维化。血管新生也是气道重塑的特征之一。NGF可通过诱导受体A的酪氨酸激酶活性和激酶-调节蛋白激酶2磷酸化增加血管内皮生长因子的释放，间接促进血管生成[15]，并能直接刺激血管生成[16]。本研究也显示，CVA患者诱导痰NGF浓度较N组明显升高，差异有统计学意义，提示NGF与CVA发病机制有关。且NGF浓度与HRCT气道重塑指标WA/BSA、WA%和T/√BSA相关，表明NGF与MMP-9共同参与了CVA气道重塑进程，并可以作为评估CVA气道重塑的非创伤性指标。
综上所述，诱导痰MMP-9、NGF可作为评价CVA气道重塑的生物标志物，HRCT检查可作为无创手段更广泛用于气道重塑的评估。联合生物标志物及HRCT可更全面评价CVA患者气道重塑情况，从而更好地指导临床治疗。
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（收稿日期：2013-03-19 本文编辑：林利利）