裸花紫珠试管苗生产技术初探
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摘要：以带腋芽的裸花紫珠（Callicarpa nudiflora Hook. et Arn.）嫩茎段为外植体，研究其组培快繁技术。结果表明，用0.1%的升汞处理外植体15 min， 接种于MS+1.5 mg/L 6-BA+30 g/L蔗糖培养基上，7 d后萌发腋芽；丛生芽在MS+2.0 mg/L 6-BA+30 g/L蔗糖的培养基增殖效果最佳，增殖系数达8.50；丛生芽的继代培养周期是30 d，超出40 d时会有死株现象；培养基MS+0.5～0.8 mg/L NAA+0.5 g/L活性炭+30 g/L蔗糖适宜诱导生根，生根率达100%；生根苗移栽在V河沙∶V木屑∶V园土=1∶1∶1的混合基质中，塑料薄膜保湿20 d成活率达93%，且植株生长良好。
关键词：裸花紫珠（Callicarpa nudiflora Hook. et Arn.）；试管苗；茎段；组织培养
中图分类号：S567.1+9；Q943.1 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）13-3121-03
Production Technologies of Callicarpa nudiflora Hook. et Arn. Test-Tube Plantlets
HUANG Sai，PAN Mei，QI Hua-sha，WANG Jing-fei，L？ De-ren
（Institute of Horticulture and Flower， Hainan Academy of Agricultural Sciences， Haikou 571100， China）
Abstract： Using tender stem segments of Callicarpa nudiflora as explants， the techniques of tissue culture and rapid propagation in vitro were studied. Results showed that the optimum disinfector was 0.1% HgCl2 for 15 min， with MS+6-BA1.5 mg/L+ sucrose 30 g/L as the initial medium. After inoculation for 7 d， the axillaries buds began to germinate. Using MS+6-BA 2.0 mg/L + sucrose 30 g/L as the proliferation medium， the proliferation multiples reached 8.50. The best cycle of subculture training was 30 d. The plantlets would appear dead when more than 40 d. The rooting culture medium was MS+NAA 0.5～0.8 mg/L+ active carbon 0.5 g/L + sucrose 30 g/L，with the best rooting effect and the rate of rooting of 100%. When the rooted seedlings were transplanted into the mediums of sand∶soil∶sawdust（1∶1∶1） and covered with plastic film for keeping moisture for 20 d， the survival rate reached up to 93%.
Key words： Callicarpa nudiflora Hook. et Arn.； test-tube plantlet； stem segment； tissue culture
裸花紫珠（Callicarpa nudiflora Hook. et Arn.）为马鞭草科紫珠属植物，是海南黎族医生常用药材之一。分布在海南的定安、儋州、澄迈、白沙、昌江、东方、三亚、陵水、保亭、琼中等地，尤其产于五指山的为上品[1]。具有抗菌、止血、散瘀消肿之功效，主治各种炎症、外伤出血、跌打肿痛、风湿肿痛、肺结核咳血、胃肠出血等症[2，3]。随着南药开发利用的不断深入，裸花紫珠的市场需求量不断增大，但供应渠道仍以野生采伐为主，不仅不能满足市场的需求，而且还导致了严重的生态问题。由于裸花紫珠的人工常规育种能力低，难于进行大规模繁殖育种，直接影响其种植生产。目前国内研究报道侧重在药理分析、治疗效果等方面[4-7]，在组织培养方面较少[8，9]，因此，裸花紫珠试管苗生产技术研究在生产中具有重要的推广价值。
1 材料与方法
1.1 材料
裸花紫珠嫩茎段采自海南省农业科学院花卉研究所苗圃。
1.2 方法
1.2.1 外植体处理 选取带腋芽的裸花紫珠嫩茎段，在自来水下冲洗干净，在超净工作台上用75%的酒精浸泡10 s，再转入0.1%的升汞中消毒15 min，用无菌水冲洗5次后对其进行切割接种。切割时，切去与升汞接触到的切口，接种于MS+1.5 mg/L 6-BA培养基中。为避免交叉感染，每袋只接种一个腋芽茎段。
1.2.2 培养基 以MS为基本培养基，在不同阶段的培养基中分别添加不同的激素。所有培养基均含有30 g/L蔗糖（蔗糖浓度比较试验除外），7 g/L的卡拉胶，pH 5.8。分装的培养基均经121 ℃，0.14 MPa灭菌20 min[10]。
1.2.3 培养条件 培养温度（26±2） ℃，光照度1 100～1 500 lx，光照时间9 h/d。
1.2.4 移栽基质 移栽基质采用V河沙∶V珍珠岩：V园土=1∶1∶1混合而成。
2 结果与分析
2.1 裸花紫珠无菌材料的获得和芽的诱导
接种后外植体开始分泌褐色物质，3 d后培养基开始呈现褐色，10 d左右培养基褐色加深，在7 d左右开始萌发腋芽。萌发出的腋芽即可用解剖刀切取，转入相同的培养基进行增殖培养。周而复始，可获得较大数量的丛生芽。
2.2 裸花紫珠丛生芽的增殖
2.2.1 不同细胞分裂素对裸花紫珠丛生芽诱导的影响 为了筛选出较适宜裸花紫珠增殖的细胞分裂素，以MS为基本培养基，以浓度均为2.0 mg/L的6-BA、KT、ZT、TDZ 4种处理进行比较试验，接种30 d后的观察结果见表1。从表1可以看出，6-BA对裸花紫珠增殖培养效果最好，增殖系数最大，达8.50，丛芽的长势好，芽苗健壮，色绿，整齐，分化多，苗高2～3 cm；其次为TDZ，增殖系数为5.62，分化芽较多，但芽苗黄，节短，茎基部膨大少许，死株较多；添加KT的增殖系数为3.22，长势一般，节较密，少数株死亡，苗高1.0～1.8 cm；表现最差的是ZT，增殖系数仅为2.88，长势较好，叶片较大，节间长，分化不整齐，苗高1～4 cm。因此，裸花紫珠增殖培养选用细胞分裂素6-BA较合适。
2.2.2 不同浓度6-BA对裸花紫珠丛生芽增殖的影响 为了筛选出较适宜裸花紫珠增殖的6-BA浓度，以MS为基本培养基，设0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mg/L 9个浓度梯度进行比较试验，30 d后观察丛生芽的增殖情况，结果见表2。表2结果表明，6-BA浓度在0～2 mg/L时，丛生芽的增殖系数随着6-BA浓度的升高而升高。当6-BA浓度大于2 mg/L时，反而抑制了丛生芽的增殖生长，随着6-BA浓度的增大，增殖系数越来越小。从丛生芽的生长状况来看，0、0.5、1.0、1.5 mg/L处理的丛生芽植株生长较细，株高1～2 cm；3.0～4.0 mg/L处理的丛生芽植株也细，株高1.0～1.5 cm，且还出现了不同程度的玻璃化苗；2.0 mg/L处理的丛生芽植株生长健壮，株高2.0～2.5 cm；2.5 mg/L处理的丛生芽植株高2.0～2.5 cm，但没有2.0 mg/L处理的健壮。因此，从增殖系数和丛生芽的生长情况来看，培养基MS+2.0 mg/L 6-BA对丛生芽的增殖效果最好。
2.2.3 不同浓度蔗糖对裸花紫珠丛生芽增殖的影响 为了筛选出较适宜裸花紫珠增殖的蔗糖浓度，设计MS+2.0 mg/L 6-BA+蔗糖（浓度为0、20、30、40 g/L）4种处理培养基进行比较试验，30 d后观察丛生芽的增殖情况，结果见表3。表3结果表明，蔗糖浓度30 g/L时有利于丛生芽的增殖，增殖系数最大，丛生芽生长的长势好，叶片平展，健壮，色绿，整齐。蔗糖浓度过高或过低均不利于丛生芽的增殖生长。在蔗糖浓度0～20 g/L时，丛生芽增殖系数低，芽苗长势差，分化不整齐；在蔗糖浓度40 g/L时，丛生芽增殖系数较低，芽苗叶片弯曲，茎尖叶片变小，因此裸花紫珠丛生芽继代增殖培养的适宜蔗糖浓度为30 g/L。
2.2.4 不同培养时间对裸花紫珠丛生芽增殖的影响 为了筛选出裸花紫珠继代增殖最佳转瓶时间，将丛生芽接入MS+2.0 mg/L 6-BA培养基中，总共接种120袋，每袋放置3块丛芽，放入同层培养架上培养。在培养20、25、30、35、40 d时，每次随机抽取7袋，分别求其增殖系数，观察生长情况进行比较，结果见表4。表4结果表明，培养时间在20～30 d时，随着培养时间的延后，丛生芽的增殖系数加大，芽苗增高；当培养时间达到35 d时，增殖系数下降，芽苗不再长高；当培养时间超过40 d时，芽苗出现死亡现象。因此，裸花紫珠丛生芽继代增殖培养周期为30 d。
2.3 裸花紫珠生根培养
为了筛选出裸花紫珠试管苗生根培养基，以MS为基本培养基， 附加0.5 g/L活性炭，设置NAA 0、0.2、0.5、0.8、1.0、1.5 mg/L共6个处理， 将高2 cm的小苗转入上述生根培养基，每个处理接种20袋，每袋接种8株，30 d后观察生根情况，结果见表5。从表5可见，在添加NAA浓度小于0.8 mg/L时，裸花紫珠的平均生根条数和平均根长会因NAA浓度的升高而增加。当NAA浓度为0.8 mg/L时，平均生根条数最多，达到12条，平均根长最长，为1.65 cm。在添加NAA浓度达到1 mg/L时，裸花紫珠的平均生根条数和平均根长会因浓度的升高而降低。从平均株高和生根率来看，NAA浓度为0.5～1.0 mg/L时，生根率都达到100%。从生长状况来看，NAA浓度过高或过低都不利于根系的生长，当浓度过高时，根基会出现愈伤组织，发根少、短；当浓度过低时，发根少、细长。当NAA 浓度为0.5～0.8 mg/L时，裸花紫珠发根多、粗壮。因此，培养基MS+NAA 0.5～0.8 mg/L+0.5 g/L活性炭适于裸花紫珠生根培养。
2.4 试管苗的炼苗移栽
由于组培苗一直生长在相对恒定的温度、光照环境中，对外界多变的自然环境一时难以适应，移栽前要经过一个充足炼苗的过程才能提高移栽成活率。裸花紫珠炼苗是取根系发达、株高达3 cm的生根苗，移置阴棚里培养20 d左右。移栽前要洗净根部附着的培养基，然后移栽到V河沙∶V木屑∶V园土=1∶1∶1混合基质中，淋足定根水，盖塑料薄膜保湿20 d。试管苗移栽40 d后即可成活，其成活率可达93%。
3 小结与讨论
试验中在培养初期出现了褐化现象，但有腋芽萌发时这种现象就大大减轻了。可能是萌发的腋芽处于旺盛的生长状态，其分生能力强的类型细胞大量增殖，酚类物质被氧化受到抑制的缘故[11]。因此，认为在裸花紫珠嫩茎段消毒时只要严格控制消毒液浓度和消毒时间，就能有效控制材料的褐化。裸花紫珠嫩茎灭菌比较困难， 因为裸花紫珠嫩茎表面有绒毛，用0.1%升汞消毒 15 min可获得无菌材料，无菌材料在MS+1.5 mg/L 6-BA上7 d后可以抽出新芽，新芽在同样的培养基上易形成丛生芽。裸花紫珠增殖适宜的细胞分裂素是6-BA，它是芽苗增殖扩繁的关键，适宜的浓度2.0 mg/L对芽苗增殖生长起促进作用。6-BA浓度过高或过低，芽苗长势细弱，增殖系数低。当6-BA浓度达到3 mg/L时出现玻璃化苗现象。同时丛生芽在MS+2.0 mg/L 6-BA上增殖培养最适的蔗糖浓度是30 g/L，浓度过高或过低都会影响增殖效果。此外，丛生芽在培养30 d时，丛芽的生长量最大，增殖系数最高，为8.19，是转瓶的最佳时间。研究表明培养基MS+ NAA 0.5～0.8 mg/L+0.5 g/L活性炭适宜诱导裸花紫珠生根，生根率达100%，根系质量好，而NAA浓度达到1 mg/L会产生鸡爪根。裸花紫珠组培苗对移栽基质与环境要求高，在加盖塑料薄膜保湿的环境中，裸花紫珠移栽在基质河沙：园土：木屑体积比为1∶1∶1时表现最好，成活率最高，达93%，新长出的叶大而绿，茎粗叶茂，植株健壮，根系发达粗壮。
试验以裸花紫珠的带节茎段作为接种材料， 通过芽生芽的方式进行快速繁殖，有利于保持原植物的优良遗传特性及有效成分，为该药用植物的繁殖提供了新的途径[12]。
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