马铃薯茎尖组织培养脱毒技术要点
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1.1脱毒方法
1.1.1选择优质健康的材料 所选的植株必须是表现典型品种特性的植株,符合脱种的特征包括株型、叶形、花色等植物学性状及成熟期等农艺性状;植株生长健壮,无明显的病毒性、真菌性、细菌性病害症状;单株产量和大薯率高;适时早收,选择符合品种特性,无病斑、虫蛀和机械创伤的大薯块。
1.1.2选择培养基 MS培养基适用于大多数双子叶植物,B5和N6适合大多数单子叶植物,马铃薯茎尖培养基以MS+GA30.05mg/l +6-BA0.5～0.1mg/l +NAA0.1～0.2mg/l+2%蔗糖+0.9%琼脂配方效果比较好。
1.1.3剥离和接种 薯块休眠后进行室内催芽,待芽长至1～2cm还未展叶时,将芽剪下,然后放入烧杯,用纱布封口,在自来水下冲洗半个小时,取出放到操作台上进行消毒。消毒方法是将芽在75%的酒精中过一遍(约20秒),然后用次氯酸钠溶液稀释为2%～3%,浸泡2分钟,然后用无菌水清洗3～5次。将消毒过的芽放在垫有吸水纸的培养皿上,每次消毒的芽不要太多,以防放置时间过长,茎尖褐变(消毒过程中所用器具均已事先高温灭菌)。在操作台使用前先打开紫外线消毒30分钟,然后关闭紫外线灯,打开风机。实验前换专用服装,双手用75%酒精擦拭消毒,取消毒处理过的芽,以无菌镊子固定,在30～40倍解剖镜下进行茎尖分生组织剥离。用解剖针小心地除去茎尖周围的叶片组织,暴露出顶端圆滑的生长点,用解剖针切取0.1～0.3mm,带有1～2个叶原基。茎尖剥离时为防止解剖镜近距离灯光烤伤茎尖分生组织,解剖镜光源要用冷光源照明。切取的茎尖分生组织随即接种到培养基上,切面接触琼脂,置于培养室进行离体培养。
1.1.4培养条件 将已接种外植体的试管置温度23℃～25℃,光照3000lx、在光周期13～16小时/天的培养室中培养2～4周即可成苗。
2.茎尖培养的关键技术环节
2.1剥取适当大小的茎尖 通常培养茎尖越小,产生幼苗的无毒率越高,但成活率越低。不同病毒种类取出的难易程度不同。因此需针对不同的病毒种类,培养适当大小的茎尖。如剥离培养一个叶原基的生长点产生的马铃薯植株,可去除全部马铃薯卷叶病毒,去除80%Y病毒和A病毒,去除0.2%X病毒。马铃薯病毒去除难易顺序是:马铃薯纺锤块茎病毒>马铃薯S病毒>马铃薯X病毒>马铃薯M病毒>奥古巴病毒>马铃薯Y病毒>马铃薯A病毒>马铃薯卷叶病毒。对于同一种病毒,剥离茎尖越小,脱毒率越高。
2.2茎尖接种后的生长及调节方法 茎尖接种后的生长情况主要有4种:生长正常,生长点伸长,基本无愈伤组织形成,1～3周形成小芽,4～6周长成小植株;生长停止,接种物不扩大,渐变褐色,至枯死,此情况多因剥离操作过程中茎尖受伤;生长缓慢,接种物扩大缓慢,渐变绿,成一绿点,说明培养条件不适,要迅速转入高激素浓度的培养基,并适当提高温度;生长过速,生长点不伸长或略伸长,大量疏散愈伤组织形成,必须转入无激素培养基或采取降低培养温度措施。