木薯淀粉产异丁醇的重组菌株

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《生物技术杂志》2014年第二期

1材料与方法

1.1材料

1.1.1菌株及质粒E.coli菌株JM109(DE3)和地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheni-formis)均由作者实验室保存。质粒:pSE380由作者实验室保存(含Lac启动子的表达载体)。质粒pSTV29－alsS－ilvC－ilvD－kdcA由作者实验室构建，工程菌BW25113pflBfrdABfnrfnrE由作者实验室构建。

1.1.2工具酶和试剂限制性内切酶NcoⅠ、T4DNA连接酶、ProteinMarker、Primerstar聚合酶购自TAKARA公司;氨苄青霉素购自上海生物工程公司;所用试剂盒购自天根公司。

1.1.3培养基和培养条件细菌培养基:LB+氨苄青霉素(100mg/mL);淀粉酶活性筛选平板:LA+氨苄青霉素(100mg/mL)+2%淀粉。发酵培养基:5%木薯粉+0.5%酵母粉。

1.1.4发酵将过夜培养的种子液按5%的接种量接种于液体发酵培养基中，37℃、250r/min，长至OD600为0.4～0.6，加入终浓度1mmol的IPTG诱导，在37℃、250r/min发酵24h。

1.1.5PCR引物根据GenBank所报道的基因序列设计以下引物上游引物:5’－CGAGCCCATGGCTAAACAACAAAAACG－3’，NcoⅠ酶切位点;下游引物:5’－GTACCCATGGTCTGTTTCCTCTATCTTT-GAACATAAATTGAAACCG－3’，NcoⅠ酶切位点。

1.2方法

1.2.1DNA的提取Bacilluslicheniformis基因组DNA及质粒DNA的提取的快速提取参照文献。

1.2.2PCR扩增扩增amyL基因反应体系为:10×PCR缓冲液10mL，dNTP(each2.5mmol/L)4mL，Primer1(10mol/L)和Primer2(10mol/L)各1mL，地衣芽孢杆菌总DNA1mL，PrimeSTARDNAPolymerase(2.5U/μL)2U，加ddH2O至50mL。反应条件:95℃变性2min;94℃30s，48℃30s，72℃2min，30个循环，最后72℃10min。

1.2.3分子克隆质粒DNA的提取、DN段的亚克隆、酶切和连接转化技术参照文献［6］，将等量的双质粒pSE380－amyL、pSTV29－alsS－ilvC－ilvD－kdcA同步转入感受态细胞中，涂布在双抗性(100mg/L氨苄青霉素+34mg/L氯霉素)LA平板上培养。

1.2.4淀粉酶阳性转化子的检测将转化液涂布于含有2%可溶性淀粉的固体LA平板上，37℃过夜培养，周围出现透明圈的即为淀粉酶阳性转化子。

1.2.5重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达将阳性转化菌落转接入100mL的LB中，37℃振荡培养2h至OD600约为0.1，加入IPTG至终浓度1mmol/L，诱导表达12h后，取1.5ml菌液于8000r/min，离心5min，收集菌体，用200μLddH2O重悬菌体，从中取20μL重悬菌液并加入等量的上样buffer，100℃煮5min，进行SDS－PAGE电泳。

1.3异丁醇发酵

过夜培养的种子液按1%的接种量接种，37℃、250r/min培养，待其长至OD600约为0.4～0.6时加入终浓度1mmol的IPTG诱导，在30℃、250r/min发酵24h。

1.4分析方法

1.4.1质粒稳定性的检测质粒稳定性的测定参照文献［7］进行。

1.4.2异丁醇产量检测检测仪:Agilent6890气相色谱仪。检测条件:FID(220℃)检测器;phenomenZB－WAXplus色谱柱;进样口压力为16.92psi;氢气流量为30mL/min;柱箱温度为100℃;进样量0.2mL。

2结果与分析

2.1基因扩增提取地衣芽孢杆菌的总DNA作为模板，扩增amyl基因，用0.8%的琼脂糖凝胶进行电泳检测，获得一条大小约为1569bp单一特异性条带，与预期目的条带大小一致(图1)。

2.2表达载体的鉴定将载体pSE380与PCR扩增amyl基因片段产物酶切并去磷酸化，连接转入大肠杆菌JM109(DE3)中，涂布于筛选平板(含100mg/mL的Amp，IPTG，2%的淀粉)，37℃过夜培养24h，挑取其中6个有透明圈的单菌落转点于新鲜的淀粉板上，24h后挑取透明圈较小的JM109(DE3)/pSE380－amyl－1及较大的JM109(DE3)/pSE380－amyl－2(如图2)单菌落分别提质粒测序。通过测序的JM109(DE3)/pSE380－amyl－1及JM109(DE3)/pSE380－amyl－2，经培养、IPTG诱导表达后，分别取上清液及菌体沉淀进行SDS－PAGE电泳分析，结果如图3，从图3中可以看出，重组菌与对照菌相比发现在56kDa处出现特征蛋白条带，与核酸序列理论推算蛋白质分子量基本相符，表明amyl基因已在大肠杆菌中成功地表达。

2.3pSE380－amyl与pSTV29－alsS－ilvC－ilvD－kdcA共表达制备工程菌BW25113pflBfrdABfnrfnrE感受态，分步转入pSE380－amyl－1(pSE380－amyl－2)和pSTV29－alsS－ilvC－ilvD－kdcA，获得的工程菌命名为gxas－AIKA1(gxas－AIKA2)。

2.4质粒的稳定性检测取工程菌gxas－AIKA连续传代培养，定期取样分别稀释涂布于抗性平板与无抗性平板上，显微计算出抗性平板上与无抗性平板上的菌落数之比，以此比值与培养时间联合考察发现该工程菌株的稳定性良好。

2.5异丁醇产量测定内标:正丁醇。气相分析结果如图4、图5，发现工程菌gx-as－AIKA1和gxas－AIKA2均能直接利用木薯淀粉生产异丁醇，并且工程菌gxas－AIKA1以5%木薯粉+0.5%酵母粉为发酵培养基发酵的效果更好。

3讨论

由于在工业生产中直接利用葡萄糖作为发酵原材料的经济成本较高，木薯淀粉作为产量大、价格便宜的可再生资源，用作发酵生产异丁醇的培养基原料有着独特的优势。本研究尝试以地衣芽孢杆菌的基因组DNA为模板，PCR扩增了淀粉酶基因，构建了表达质粒pSE380－amyl，并将该质粒与接被本研究所构建的重组菌株发酵生产异丁醇。为了进一步提高工程菌直接利用木薯淀粉生产异丁醇的产量，本研究小组已经着手提高该菌株异丁醇耐受性，优化异丁醇发酵工艺水平的研究。

作者：郭媛林丽华庞浩陈燕刘春宇裴建新黄日波单位：广西科学院非粮生物质酶解国家重点实验室国家非粮生物质能源工程技术研究中心广西生物炼制重点实验室