线粒体损伤在脓毒症大鼠心肌细胞凋亡中的作用

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【摘要】目的 探讨线粒体损伤在脓毒症大鼠心肌细胞凋亡中的作用及其可能机制。方法 72只SD大鼠随机（随机数字法）分为2组：（1）阴性对照组18只，腹腔注射无菌生理盐水；（2）脓毒症组，按大肠杆菌内毒素注射后6、12、24 h分为3个亚组，各18只。取心脏组织，光镜和电镜下观察组织病理学和超微结构的变化，TUNEL法原位检测心肌细胞凋亡并计算凋亡指数，免疫印迹法检测核转录因子-κB（NF-κB）p65的表达，黄嘌呤氧化酶法测定线粒体超氧化物歧化酶（SOD）活性，比色法检测线粒体还原型谷胱甘肽（GPx）活性，硫代巴比妥酸法测定线粒体脂质过氧化产物丙二醛（MDA）含量，OxyBlot TMas 蛋白氧化检测试剂盒观察线粒体蛋白氧化。结果 脓毒症大鼠心肌有炎症细胞浸润，细胞水肿及空泡形成，并且在24 h最明显；心肌细胞凋亡指数和白NF-κB p65活化均显著增加（P

【关键词】脓毒症；心肌损伤；细胞凋亡；线粒体；核转录因子-κB

Role of damaged mitochondria in cardiocyte apoptosis in septic rats LI Li， YAN Jing， CHEN Chang-qin， GONG Shi-jin， DAI Hai-wen， YU Yi-hua， CAI Guo-long， CHEN Jin， X Qiang-hong. Intensive Care Unit， Zhejiang Hospital， Hangzhou 310013， China

Corresponding author： YAN Jing， Email： .cn

【Abstract】Objective To investigate the role of damaged mitochondria in cardiac cell apoptosis in septic rats and the possible mechanism involved. Methods Seventy-two Sprague-Dawley rats were randomly （random number） divided into negative control group （n=18） and septic group （further divided into three groups as per rats sacrificed 6 h， 12 h， and 24 h after endotoxin injection intra-peritoneally， n=18）.The hearts of rats were taken. The changes of cardiac morphology were observed under light microscope and scanning electron microscope. Cell apoptosis in situ were examined by using terminal transferase-mediated dUTP nick end-labeling assay and nuclear factor-kappa B （NF-κB） activation in myocardium was detected by using Western blotting to estimate myocardial cell apoptosis.Mitochondrial lipid and protein oxidation were measured to assess oxidative stress， and mitochondrial superoxide dismutase （SOD） and glutathione peroxidase （GPx） activities were determined to estimate antioxidant defense. Results Septic induced inflammatory cells infiltration， myocardium degeneration and effusion in a time-dependent manner. A remarkable expansion of capillaries could be observed in the hearts of infected rats at post-challenge of 24 h. Compared with sham-treated rats， the percentage of apoptosis increased in a time-dependent manner in the hearts of infected rats at 6 h， 12 h， 24 h of post-injection （P

【Key words】Sepsis；Myocardial injury； Cell apoptosis； Mitochondrial； Nuclear factor-kappa B

在脓毒症患者中有近50%存在左室收缩/舒张功能异常，尤其是严重脓毒症和脓毒症休克患者[1-2]。而合并心功能不全的患者，其病死率可由20%增加到70%～90%[3-4]。研究表明，心肌细胞凋亡是参与脓毒症导致的心肌功能障碍的重要机制之一。线粒体不但是心肌能量代谢的主要场所，而且是细胞凋亡的重要机制之一。但是脓毒症时心肌线粒体的变化尚不清楚，其与脓毒症心肌功能障碍的关系未见相关报道。本研究观察脓毒症心肌线粒体结构和功能的变化，欲探讨线粒体损伤在脓毒症大鼠心肌细胞凋亡中的作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物和试剂

健康成年Sprague-Dawley（SD）大鼠72只，雄性，月龄4个月，体质量250～300 g。由浙江中医药大学实验动物中心提供。脂多糖购自Sigma公司（美国）；白提取试剂盒购自美国Pierce公司；细胞凋亡原位检测试剂盒购自美国Roche公司；抗脱氧核糖白（DNP）抗体和抗GAPDH抗体购自美国Chemicon公司，抗核转录因子-κB（NF-κB）p65抗体和抗c-JUN抗体购自美国Santa Cruz公司；ECL显色系统购自英国Amersham公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性、丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量及谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GPx）活性检测试剂盒均购自美国Calbiochem公司。

1.2 实验方法

1.2.1 实验动物分组及标本采集 72只SD大鼠随机（随机数字法）分为阴性对照组和脓毒症组。阴性对照组18只，腹腔注射无菌生理盐水。脓毒症组10 mg/kg腹腔注射大肠杆菌内毒素（Escherichia coli 055∶B5），按内毒素注射后6、12、24 h三个时间点分为3个亚组，每亚组18只，共54只。大鼠按照各个时间点注射麻醉，剖开胸腔，暴露心脏，心脏组织各取1/3分别以10%多聚甲醛、2.5%戊二醛固定或液氮保存备用。

1.2.2 病理组织切片和透射电镜检查 心肌组织块经10%多聚甲醛固定，石蜡包埋、切片、HE染色后光镜下观察。心肌组织块经2.5%戊二醛固定，醋酸铀和枸橼酸铅双重染色，超薄切片，透射电镜观察。

1.2.3 原位心肌细胞凋亡检测 原位细胞凋亡检测采用TdT-mediated dUTP nick-end labeling（TUNEL）试剂盒。具体操作步骤参见说明书。细胞凋亡指数=（阳性细胞数/总细胞数）×100%。每张切片数5个高倍视野（×200），每个视野不少于500个细胞。

1.2.4 心肌胞浆蛋白、线粒体蛋白和白的提取 心肌组织置于组织匀浆液中，以匀浆器研磨制成组织匀浆。4 ℃离心分别600 g×5 min，10 000 g×30 min，10 000 g×30 min。第2次离心所得沉淀即为线粒体蛋白，以含10 mmol/L HEPES-KOH、200 mmol/L 甘露醇、70 mmol/L 蔗糖、1 mmol/L EGTA的缓冲液溶解。第3次离心所得上清为胞浆蛋白。心肌组织置于白提取液中，匀浆器研磨制成组织匀浆。4 ℃，10 000 g×30 min离心，沉淀以缓冲液[20 mmol/L HEPES （pH 7.9）、1.5 mmol/L MgCl2、0.42 mol/L NaCl、0.2 mmol/L EDTA、25%体积分数的甘油、l μmol/L DTT/蛋白酶]溶解后继续离心4 ℃，20 000 g×10 min。上清即为白。

1.2.5 免疫印迹 Bradford法测定胞浆蛋白或白浓度，取10 μl蛋白变性，配制10% Tris-甘氨酸SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳，转移至硝酸纤维素膜上。分别与抗GAPDH、DNP、NF-κB p65、c-JUN抗体室温下孵育1 h。继与辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育1 h。ECL显色系统X光片感光显影。以Qwin图像分析系统（Leica，德国）定量各蛋白条带的总灰度值。

1.2.6 线粒体氧化还原功能检测 采用黄嘌呤氧化酶法测定线粒体SOD活性，采用硫代巴比妥酸法测定线粒体MDA含量。还原型谷胱甘肽和二硫代二硝基甲酸作用生成5-硫带二硝基甲酸阴离子呈现较稳定的黄色化合物，测定其在340 nm 处的吸光度计算出还原型谷胱甘肽的量。GPx活性（mU/ml）=[A340（样品）/min-A340（空白）/min]/0.006 22。采用OxyBlot TMas 蛋白氧化检测试剂盒观察心肌线粒体蛋白的氧化——线粒体蛋白氧化修饰后蛋白羰基化。

1.3 统计学方法

采用SPSS 13.0软件进行统计学分析，数据以均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验，多组均数间的比较采用方差分析。以P

2 结果

2.1 脓毒症大鼠心肌细胞凋亡的变化

与对照组相比，脓毒症大鼠心肌有炎症细胞浸润，细胞水肿及空泡形成，并且在24 h最明显。对照组大鼠心肌空泡面积仅为（1.0±1.4）%，脓毒症组大鼠心肌空泡面积显著增加，并且随着时间的延长空泡面积逐渐增加，6、12、24 h空泡面积分别为（10.2±2.8）%、（16.3±3.7）%、（19.8±4.4）%（P

2.2 脓毒症大鼠心肌NF-κB活性的变化

NF-κB是重要的炎症介质，其活化后从胞浆转位细胞核中。本研究采用免疫组织化学方法，分别观察脓毒症大鼠心肌胞浆和细胞核成分中NF-κB p65的表达。结果发现，6、12、24 h胞浆蛋白NF-κB p65的表达分别为阴性对照组的（82±18）%、（63±16）%、（64±13）%，而白NF-κB p65的表达分别增加了（3.24±0.42）倍、（4.13±0.98）倍、（4.54±1.34）倍（P

2.3 脓毒症大鼠线粒体形态变化

电镜下，脓毒症6 h组大鼠心肌线粒体病变不明显；脓毒症12 h组大鼠心肌线粒体嵴消失，排列紊乱，有空泡形成；至24 h病变最严重，线粒体膜破碎，线粒体嵴消失，大量空泡形成。见图4。

2.4 脓毒症大鼠线粒体功能变化

6、12、24 h组脓毒症大鼠心肌线粒体SOD和GPx活性随时间延长而下降，24 h时活性最低。与阴性对照组相比，差异均具有统计学意义（P

6、12、24 h组脓毒症大鼠心肌线粒体MDA浓度和抗DNP抗体表达水平随时间延长而增加，24 h时达高峰。与阴性对照组相比，差异均具有统计学意义（P

3 讨论

Rudiger和Singer研究[5]发现，脓毒症大鼠心肌细胞凋亡增加。在我们的研究中，脓毒症大鼠心肌细胞水肿和空泡变性随着时间的延长而增加；TUNEL法原位检测心肌细胞凋亡，发现脓毒症心肌细胞凋亡显著增加，在24 h最明显；并且脓毒症大鼠心肌组织NF-κB的活性随着时间的延长逐渐增加；上述结果进一步证实脓毒症大鼠心肌细胞发生凋亡。更为重要的是，我们研究发现脓毒症大鼠心肌线粒体结构和功能发生一系列的变化。在第12 h脓毒症大鼠心肌线粒体损伤明显，表现为线粒体嵴消失，排列紊乱，有空泡形成；至24 h病变最严重，表现为线粒体膜破碎，线粒体嵴消失，大量空泡形成。1971年Mela首次在感染性休克大鼠的肝脏中发现线粒体超微结构变化。随后，Francesca 等[6]采用猪的脓毒症模型比较不同组织线粒体的变化，发现肝脏细胞线粒体最易受损，其线粒体呼吸链复合酶Ⅰ、Ⅱ活力明显下降；而肾脏和骨骼肌细胞线粒体均未见明显改变。Trumbeckaite等[7]采用兔的脓毒症模型，发现较小剂量内毒素（100 μg/kg）时骨骼肌细胞线粒体呼吸链酶未见明显损伤，但是在较高剂量（150 μg/kg）时线粒体呼吸链复合酶Ⅰ、Ⅲ活力下降。而心肌细胞线粒体较骨骼肌敏感，在较低剂量时即出现呼吸链复合酶Ⅰ、Ⅲ活力的显著下降。

线粒体不仅是细胞的能量工厂，而且是细胞的凋亡控制中心。许多因素包括炎症反应、缺血-再灌注等均可以使线粒体损伤而诱导细胞凋亡。由于线粒体DNA对氧自由基很敏感，极易被活性氧损伤，因此线粒体途径是活性氧诱导细胞凋亡的重要途径之一。生理状态下，细胞内存在GPx，过氧化氢酶（catalase，CAT）和SOD等抗氧化酶系统，但是在炎症反应、缺血-再灌注等病理条件下，抗氧化酶失活，活性氧过度产生，超出了细胞的抗氧化能力，造成氧化应激。活性氧可以直接攻击心肌线粒体膜脂，引起心肌线粒体膜的脂质过氧化损伤，使得线粒体膜心磷脂显著减少、线粒体细胞色素氧化酶活性下降；活性氧和脂质过氧化物的增多又可以使膜磷脂分解代谢增强，后者促进活性氧和脂质过氧化物进一步增多，形成恶性循环，终致线粒体内膜完整性受到破坏，线粒体功能失调和能量代谢障碍。文献[8]报道，线粒体抗氧化物的失活导致线粒体易产生氧化损伤。在SOD-/+小鼠中SOD活性下降导致线粒体膜的稳定性下降，铁硫蛋白活性降低，及线粒体DNA的8-氢氧化尿苷hydroxydeoxyguanosine活性升高。在GPx基因缺陷的小鼠中也存在线粒体的氧化损伤[9-10]。在本研究中，脓毒症大鼠心肌线粒体SOD和GPx活性显著下降，而心肌线粒体MDA和DNP显著增加。MDA为膜脂质过氧化的产物，DNP为蛋白质氧化的产物。这表明脓毒症大鼠心肌线粒体发生脂质和蛋白过氧化损伤。Reynolds等[11]在脓毒症大鼠模型中发现，心脏线粒体DNA过氧化损伤。笔者认为，脓毒症时可能通过下调心肌线粒体的抗氧化能力增加心肌的氧化应激，并最终导致心肌细胞凋亡。

尽管缺乏直接证据证实心肌细胞凋亡是线粒体损伤直接导致的，但是已有研究报道，心肌细胞在TNF-α等细胞因子的作用下通过线粒体途径导致细胞凋亡[12-13]。另外，线粒体氧化应激导致NF-κB活化，线粒体基质蛋白如线粒体抗病毒信号蛋白（mitochondrial antiviral signaling protein，MASP）及其下游的激酶-4是NF-κB活化的信号分子[14-15]，线粒体钙离子调节细胞因子（如IL-1β， IL-6和TNF-α）分泌，上述因子进一步参与细胞凋亡。因此，笔者认为线粒体功能障碍可能是心肌细胞凋亡的重要机制之一。

综上所述，线粒体损伤在脓毒症心肌细胞凋亡中发挥作用，其作用机制可能与线粒体抗氧化物酶活性降低及活性氧产生过多和聚集有关。但是，其具体机制尚需进一步研究。

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（收稿日期：2012-07-21）

DOI：10.3760/cma.j.issn.1671-0282.2012.11.009

基金项目：国家自然科学基金面上项目（81171784）；浙江省自然科学基金（Z2100237，Y2110801）；浙江省医药卫生科学研究基金计划项目（2010KYB017）

作者单位：310013 杭州，浙江医院重症医学科

通信作者：严静，Email：.cn

中华急诊医学杂志2012年11月第21卷第11期Chin J Emerg Med，November 2012，Vol.21，No.11

P1221-P1225