茵陈水溶性提取物体外抗巨细胞病毒效应的实验研究
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摘要：目的：探讨茵陈水溶性提取物溶液体外抗人巨细胞病毒(HCMVAD169)的效应。方法：采用细胞病变（CPE）抑制法观察茵陈水溶性提取物溶液对HCMVAD169毒株的抑制作用，使用MTT比色法检测细胞的损伤程度，并利用吸光度（A）值评价茵陈水溶性提取物溶液的抗HCMV的效应。结果：茵陈水溶性提取物溶液半数中毒浓度(TC50)为904.49mg・L-1，半数有效浓度(IC50)为195.11mg・L-1mg・L-1，治疗指数(TI)为4.64。茵陈水溶性提取物溶液具有抗HCMV的作用，且其作用随药物浓度的增高而增强。结论：体外实验证实，茵陈水溶性提取物是理想的抗HCMV中药。
关键词：茵陈；抗病毒作用；巨细胞病毒
巨细胞病毒（cytomegalovirus）是一种疱疹病毒科β属的双螺旋DNA病毒，在自然界广泛存在。正常人中CMV的潜伏感染率很高,血清学检查阳性率达40%~90%。普通人群感染后并不表现出症状,但在免疫缺陷或免疫抑制人群中却有极强的致病性,肾移植后有症状的临床感染发病率是20%～60%,如果没有有效治疗,死亡率可高达90%。在器官移植术后,尤其在使用免疫抑制剂的情况下,受体感染CMV的机率更高［1］，甚至引起严重的CMV疾病。CMV病治疗目前国内外都以更昔洛韦作为首选［2］,而目前常用的更昔洛韦等几种西药都存在毒副作用大、价位高、长时间使用耐药等缺点,临床观察表明在更昔洛韦耐药病人中易产生严重的并发症,包括异体移植物的丧失、持久的视力损害等的发生率高达80%［3］。而传统的中药制剂毒副作用小,价格低廉,服用方便，同时还有其他如抗菌、提高免疫力等效能。本研究所采用CPE和MTT方法观察并测定茵陈水溶性提取物溶液对HCMVAD169毒株液的抗病毒效用，为发现有效药物应用于临床防治巨细胞病毒感染提供实验依据。
1材料与方法
11材料
111人胚肺成纤维细胞(HEL)由山东省医学科学院基础研究所微生物研究室提供。实验所用为413代细胞。细胞生长液为RPMI1640溶液加10%新生小牛血清,200kU・L-1青霉素,200kU・L-1链霉素。细胞维持液为RPMI1640溶液加2%新生小牛血清,所加抗生素同生长液。
112病毒HCMVAD169由山东医学科学院基础研究所微生物研究室提供,按常规增殖至实验需求量,测定半数组织培养感染数量TCID50=10-3.71。
113药物注射用更昔洛韦(GCV)购于广东阳江制药有限公司,批号：国药准字H20033717,粉剂,每支250mg。将GCV溶于注射用水中,配制成50g/L浓度,临用时用维持液配成不同浓度的溶液。茵陈水溶性提取物由北京师范大学资源学院资源药物工程研究中心提供，临用时用维持液配成不同浓度的溶液。
114主要试剂MTT［3(4,6二甲基噻唑2xl)2,5乙苯基四唑溴盐］、新生小牛血清、胰蛋白酶、Hank氏液、HEPES及二甲基亚砜(DMSO)均购自北京鼎国生物技术公司;RPMI1640粉剂购自GIBCO。
115主要仪器设备超级酶标测试仪购自美国,型号规格550;二氧化碳培养箱购自美国，型号规格Nu1700E。
12方法
121病毒感染性滴度的测定取经24小时培养后生长良好的HEL细胞,加入96孔板中，每孔100mL(约1.5×105/孔),将培养板置于5%CO2培养箱中,37℃培养18小时,待细胞长成单层,将病毒原液以10倍递次稀释法［4］稀释成9种不同浓度(10-1,10-2,10-3,10-4,10-5,10-6,10-7,10-8,10-9),每个稀释度设8个孔,将9种不同浓度的病毒液分别接种到长成单层HEL细胞的96孔板,每孔25μL,,置于5%CO2恒温培养箱内,37℃吸附1h后,弃上清,以Hank氏液洗3次,加维持液0.1mL/孔,同时设细胞对照孔8孔,置37℃,5%CO2培养箱培养,每日检查病毒生长情况,在光学倒置相差显微镜下观察细胞的形态变化并记录特征性细胞病变(CPE)的孔数,12d后记录结果。用ReedMuench法［5］计算病毒的半数感染量(TCID50)。
ReedMuench法计算公式：TCID50=10-［（H－R）/（H－L）+E］
注：R为计算的死亡率，H为略高于50%的死亡率，L为略低于50%的死亡率，E为对应H死亡率的负指数。
122药物细胞毒性试验取生长良好的HEL细胞,将细胞加入96孔板,每孔100μL(约1.5×105/孔),待细胞长成单层后,同步化24h,用未含抗生素的维持液将GCV(药物对照组)稀释成200,100,50,25,12.5,6.25，3.2mg・L-1等7个浓度;将茵陈水溶性提取物溶液亦稀释成2000，1000，500，250，125，63，32mg.L-1等7个浓度,将各浓度药物以每孔200μl加入培养板,每个浓度设4孔做实验孔,同时设正常细胞对照组各4孔。细胞MTT比色法：以CPE法观察记录药物对HEL细胞的毒性结果后，每孔加入MTT染液20μL（5mg/ml）,置5%CO2培养箱中，37℃培养4h,可见细胞内形成甲赘结晶,弃染色液,每孔加入DMSO150μL,振荡10min,直至紫蓝色沉淀(甲赘)充分溶解后,在超级酶标仪490nm波长处测吸光度(A)值,计算各药物浓度时TC50及细胞的存活率。试验重复3次，取3次平均值作为试验结果。
123药物体外对病毒增殖的抑制作用取生长良好的HEL,以每孔100μL(约9.5×104个细胞/孔)的细胞悬液加入96孔板,5%CO2培养箱中37℃培养24h,细胞长成单层,同步化24h后以每孔约100TCID50攻击量攻击细胞,于5%CO2培养箱中,37℃吸附1h,弃上清;将药液以低于IC50作8个稀释浓度分别加入细胞孔中,每孔150μL,每一稀释度设8孔,同时设立细胞对照组、病毒对照组;更换维持液隔天1次;在5%CO2培养箱中,37℃培养约8d,待病毒对照组细胞病变达到70%~80%时,每孔加入MTT20μL,继续培养4h,吸弃上清,每孔加入DMSO150μL,振荡10min,在超级酶标仪490nm波长下测吸光度(A)值,按下列公式计算细胞存活率及治疗指数(TI)并采用用统计学软件SPSS11.5的Probit回归法计算半数有效浓度(IC50)。试验重复3次,取平均值作为试验结果。
细胞存活率(%)=(试验组A值/对照组A值)×100%
TI=TC50/IC50
124光学倒置相差显微镜观察细胞的形态学变化细胞培养96h后，IC50下,光学倒置相差显微镜下观察并比较各组的细胞形态。
13统计分析
使用SPSS11.5专业统计软件进行数据分析。实验数据以平均数±标准差(±s)表示,各试验组与病毒对照组间差异性采用t检验,P<0.05认为有显著差异。
2结果
21药物的细胞毒性
GCV、茵陈水溶性提取物溶液分别在50mg・L-1，500mg・L-1以内均未见明显的细胞毒性作用,但经较高浓度的药物作用后,细胞死亡数增加,药物有明显的细胞毒性作用。GCV及茵陈水溶性提取物对HEL细胞毒性作用表现为:细胞变大变圆,颗粒增多,少量细胞聚集成团,培养液混浊,折光性增强以及吸光值明显改变。注射用更昔洛韦200，100，50，25，12.5，6.25，3.2mg・L-1对HEL细胞的细胞存活率分别为4.15%，66.8%，82.6%，90.1%，97.8%，98%，99%；茵陈水溶性提取物溶液不同药物浓度时(2000，1000，500，250，125，63，32mg.L-1)对HEL细胞的细胞存活率分别为18.6%，51.7%，81.8%，87.5%，90.8%，98%，100%。用统计学软件SPSS11.5的Probit回归法,计算药物的半数毒性浓度TC50分别为98.8mg・L-1和904.49mg・L-1。
22GCV及中药对巨细胞病毒增殖的抑制作用
HCMV对HEL的CPE的表现为细胞肿胀,变大变圆,折光性改变,胞浆内颗粒增多。将GCV以50,25,12.5,6.25，3.2mg・L-1;茵陈水溶性提取物溶液以500，250，125，63，32mg.L-1进行抑制HCMV实验,大于32mg.L-1浓度的茵陈水溶性提取物溶液均表现出较强的抑制病毒对细胞的病变作用。经统计分析,5种不同浓度下茵陈水溶性提取物溶液均具有抗病毒作用,结果见表1。用统计学软件SPSS11.5的Probit回归法,计算出GCV、茵陈水溶性提取物溶液对HEL细胞的半数有效浓度(IC50)分别为9.6mg・L-1,195.11mg・L-1。同时,采用前述的公式可计算出GCV、茵陈水溶性提取物溶液对HEL细胞的治疗指数(TI)分别为10.29,4.64。
表1GCV和茵陈水溶性提取物溶液抗巨细胞病毒效应（测定OD值）（略）
注：与病毒对照组比较，*P<0.05。
23茵陈水溶性提取物溶液及GCV抗巨细胞病毒作用的比较
在IC50下,检测茵陈水溶性提取物溶液和GCV抗巨细胞病毒的作用。经比较,发现茵陈水溶性提取物溶液的抗巨细胞病毒作用(A值)与GCV组比较差异均有显著性(P<0.05),且GCV组的平均A值高,表明茵陈水溶性提取物溶液抗HCMV作用较GCV弱。结果在IC50下GCV(9.6mg・L-1)、茵陈水溶性提取物溶液(195.11mg・L-1)的抗巨细胞病毒作用(测得A值)分别为(0.711±0.003),(0.663±0.004),P<0.05。在IC50下,GCV和茵陈水溶性提取物溶液对HCMV的抑制率分别为58.7%和42%。
病毒抑制率=（药物处理组OD值-病毒对照组OD值）/（细胞对照组OD值-病毒对照组OD值）×100%
24不同药物致HEL的形态学变化
细胞培养96h后，IC50下,光学倒置相差显微镜下可见：细胞对照组细胞贴壁生长，增殖活跃，细胞成梭型紧密排列，有极少量圆形增殖细胞，见图1；病毒对照组大量细胞变圆并脱离瓶壁，还可见到少量细胞碎片，仅少量细胞贴壁，无增殖细胞，见图2；茵陈水溶性提取物+病毒组大部分细胞贴壁生长，见一些圆型细胞在液体中漂浮，约45%细胞变成圆型或发生肿胀，其余贴壁细胞未见异常变化，见图3；更昔洛韦+病毒组细胞均贴壁生长，约20%细胞变成圆型或发生肿胀，其余细胞未见明显异常变化，见图4。4组细胞的形态学改变形象表明茵陈水溶性提取物具有抗HMCV的效用，其对HMCV的抑制作用较更昔洛韦弱。
图1细胞对照组(×40)（略）
图2病毒对照组(×40)（略）
图3茵陈+病毒组(×40)（略）
图4更昔洛韦+病毒组(×40)（略）
3讨论
中药茵陈为菊科植物茵陈蒿(ArtemisiacapillarisThunb)或猪毛蒿(ArtemisiaScopariaWaldst.etKit.又名滨蒿)的干燥地上部分,首载于《神农本草经》,性微寒,味苦、辛。有清热利湿,利胆退黄的功效。主要用于黄疸尿少,湿疮瘙痒,传染性黄疸型肝炎等症,是临床上常用的保肝中药。近年来有关茵陈的化学成分及药理作用的研究报道甚多,一些新的有效成分及药理作用不断被发现,茵陈除具有利胆保肝的作用外,还具有抗病原微生物、抗癌、降血脂、抗动脉粥样硬化(AS)、兴奋平滑肌等多方面的活性。复方茵陈一直都是302医院乙型肝炎治疗的首选药物。
本研究的体外实验证明,茵陈水溶性提取物溶液能有效抑制HCMV在细胞内的繁殖。其半数有效浓度为195.11mg・L-1,治疗指数为4.64。与病毒组比较,有显著性差异(P<0.05)。茵陈水溶性提取物溶液在半数有效浓度时,表现出较强抑制病毒对细胞的病变作用,且随药物浓度的增高抑制作用增强。实验还显示茵陈水溶性提取物溶液在32~500mg・L-1浓度时对巨细胞病毒均有明显抑制作用，说明该药的有效浓度范围宽，使用安全范围大。
姚艳红等［6］研究表明茵陈可抑制2.2.15细胞HBsAg和HbeAg的复制和表达,对细胞培养上清和细胞内DNA复制有抑制作用，该药在抗HCMV国内外尚无报道。本研究表明,茵陈单体溶液能有效抑制HCMV在细胞内的繁殖。姚艳红等［6］研究认为该药抗乙肝病毒的作用机理可能是抑制细胞内的DNA复制。该药抗HCMV机制可能与之有相似之处，但仍需深入研究。
综上所述,茵陈水溶性提取物溶液抗HCMV的效应尽管比更昔洛韦弱，但其作为中草药提取物有着价位低、毒副作用小、口服方便、长期使用不易耐药等特点，本实验已经证实了茵陈水溶性提取物溶液对HCMV有较明显的抑制作用，待深入研究其抗病毒的作用机理和进行动物实验研究取得疗效后，该药可推广到临床进行预防HCMV感染和治疗CMV病，对肾移植术后巨细胞病毒感染的防治也将取到积极作用。
参考文献
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5孙瑞元，主编.数学药理学新论.人民卫生出版社，2004，49~50.
6姚艳红,赵艳玲,山丽梅,等.复方茵陈片对乙肝病毒HBsAg和HbeAg表达的影响.抗感染病学,2004,1(3):127~128.