荜茇总生物碱对6―羟基多巴胺致帕金森病大鼠多巴胺能神经元损伤的保护作用研究
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[摘要] 目的：探讨荜茇总生物碱（PLA）对6-羟基多巴胺（6-OHDA）致帕金森病（PD）大鼠多巴胺能神经元损伤的保护作用及其可能的机制。方法：采用脑立体定位单侧纹状体注射6-OHDA建立大鼠PD模型，将PD大鼠随机分为PLA组（PLA 50 mg・kg-1・d-1），美多巴组（美多巴50 mg・kg-1・d-1）及模型组，每组15只，每日灌胃给药1次，连续6周。另随机选取15只大鼠在纹状体仅注射生理盐水作为假手术组。采用阿朴吗啡（APO）诱导的大鼠旋转及转棒实验进行行为学观察，酪氨酸羟化酶（TH）免疫组化检测大鼠黑质中TH阳性细胞数及纹状体中TH阳性纤维密度，用分光光度法检测大鼠黑质及纹状体内超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、还原型谷胱甘肽（GSH）、过氧化氢酶（CAT）、丙二醛（MDA）、一氧化氮（NO）及一氧化氮合酶（NOS）的含量。结果：帕金森病大鼠在APO诱导后出现明显的旋转行为，且在转棒上的滞留时间缩短，黑质区TH阳性细胞数及纹状体TH阳性纤维密度明显减少，组织内SOD，GSH-Px，CAT的活力降低，NOS的活力升高，MDA，NO含量升高，GSH含量降低，总抗氧化能力明显降低。PLA能明显改善PD大鼠的行为学异常，增加黑质区TH阳性细胞数及纹状体TH阳性纤维密度，提高组织内SOD，GSH-Px，CAT的活力，降低NOS的活力，降低MDA和NO含量，提高GSH含量，总抗氧化能力明显提高。结论：荜茇总生物碱对6-OHDA致PD模型大鼠的黑质细胞具有保护作用，其机制可能与抗氧化活性有关。
[关键词]帕金森病； 荜茇； 生物碱； 6-羟基多巴胺； 抗氧化
帕金森病（Parkinson′s disease，PD）是一种神经系统退行性疾病，其病理特征为黑质和纹状体多巴胺（dopamine，DA）能神经元变性缺失、纹状体DA 含量显著减少[1]。目前临床上常用左旋多巴类药物治疗PD，该类药物只能改善PD的临床症状，无法从根本上控制和阻断PD的进程。并且随着病程不断增长和用药量的加大，所显现出来的副作用也越来越明显。因此，寻找疗效确切且副作用小的药物成为研究PD药物的热点。
荜茇Piper longum L.是中蒙藏维医习用药材，具有温中散寒，行气止痛等功效，在印度也广泛应用[2]。荜茇中含有较丰富的酰胺类生物碱，并且具有抗炎、抗氧化、抗乙肝病毒和免疫调节等广泛的药理活性[3-4]。近年来的研究表明，荜茇中含量最高的胡椒碱具有很强的抗氧化作用，可以通过抑制线粒体膜通透性的改变减少MPP+诱导PC12细胞的凋亡[5]，并且对6-羟基多巴胺（6-OHDA）诱导的PD大鼠具有神经保护作用，推测可能是通过抗凋亡和抗炎机制发挥神经保护作用[6]。本课题组在前期研究工作中，已建立了荜茇总生物碱（PLA）有效部位提取制备的稳定工艺[7]，并对荜茇总生物碱的化学成分及其在大鼠体内的药代动力学和组织分布进行了研究[8-10]，为荜茇总生物碱的药效研究奠定了基础。本研究以6-OHDA单侧损伤纹状体制备PD大鼠模型，探讨荜茇总生物碱对损伤神经元的保护作用及其对氧化应激反应的影响，为开发荜茇防治帕金森病提供初步的实验依据。
1材料与方法
1.1试剂 6-羟基多巴胺（6-OHDA，美国Sigma公司，批号MKBH3054）；阿朴吗啡（apomorphine，APO，美国Sigma公司，批号 SLBB0077V）；美多巴（上海罗氏有限公司，批号SH1001）；酪氨酸羟化酶单克隆抗体（美国Sigma公司，批号101M4796）；鼠ABC检测试剂盒（美国Vector公司，批号172013）；浓缩型DAB试剂盒（北京中衫金桥生物技术有限公司，批号K133319D）；总蛋白定量测试盒（批号 20130216），超氧化物歧化酶（SOD）测试盒（批号 20130614），丙二醛（MDA）测试盒（批号 20121120），还原型谷胱甘肽（GSH）测试盒（批号 20130228），谷胱甘肽-过氧化物酶（GSH-Px）测试盒（批号 20121122），一氧化氮（NO）测试盒（批号 20130426），一氧化氮合酶（NOS）测试盒（批号20130223）均购自南京建成生物工程研究所。
1.2仪器 Stoelting脑立体定位仪（美国Stoelting公司）；大鼠旋转行为记录仪（美国Columbus Instruments公司）；大鼠疲劳转棒仪（西班牙Panlab公司）； CM 3050S冰冻切片机（德国Leica公司）；ECLIPSE80i型显微镜（日本Nikon公司）； SIGMA-3K15冷冻离心机（德国SIGMA公司）；SPECTRA max PLUS384连续光谱酶标仪（美国分子仪器公司）。
1.3荜茇总生物碱的制备 荜茇药材购于新疆维吾尔医院药房（批号PLL-10-09），由新疆药物研究所刘庆华研究员鉴定为胡椒科胡椒属植物荜茇P. longum的未成熟的果穗。称取干燥粉碎的荜茇果穗3 kg，加入85%乙醇15 L加热回流提取，提取液过滤后合并滤液，回收乙醇得到荜茇提取物。荜茇提取物溶于水后经大孔树脂采用0%，20%，40%，60%，85%的乙醇水溶液梯度洗脱，将60%乙醇洗脱流分合并后回收乙醇，减压干燥得到荜茇总生物碱有效部位，紫外分光光度法测定其总生物碱质量分数为64.43%。HPLC检测其胡椒碱、荜茇明宁碱和二氢荜茇明宁碱质量分数分别为50.68%，3.74%，0.62%。
1.4动物分组及处理 雄性SD大鼠120只，SPF级，体重220～240 g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号SCXK（京）2012-0001。实验前适应性饲养7 d。造模成功后随机分为模型组、假手术组、PLA组、美多巴组，每组15只。模型筛选24 h后开始灌胃给药，PLA组给予荜茇总生物碱50 mg・kg-1・d-1，美多巴组给予美多巴50 mg・kg-1・d-1，模型组、假手术组给予相同剂量的0.5% CMC-Na水溶液，连续给药6 周，每日1次。
1.5PD大鼠模型的制作及筛选 大鼠经10%水合氯醛（3.5 mL・kg-1）腹腔注射麻醉后，颅平位固定于大鼠脑立体定位仪上，头部备皮消毒后，切开头部皮肤，充分暴露前囟。参照Paxinos等[11]的大鼠脑立体定位图谱，确定左侧纹状体三坐标点[12]：一点为前囟前0.7 mm，矢状线左侧旁开2.6 mm，硬膜下6.0 mm；一点为前囟前0.7 mm，矢状线左侧旁开2.6 mm，硬膜下5.5 mm；另一点为前囟前0.7 mm，矢状线左侧旁开2.6 mm，硬膜下5.0 mm处。每点用微量注射器缓慢匀速（1.0 μL・min-1）注入6-OHDA（4 g・L-1，用含0.02%抗坏血酸的生理盐水配制）1.0 μL，注射完毕后留针5 min，然后缓慢退针，缝合切口皮肤，外涂青霉素粉剂预防感染。假手术组用上述相同方法向左侧纹状体注射同体积的含0.02%抗坏血酸的生理盐水。术后第5周，以皮下注射0.5 mg・kg-1APO诱发大鼠向健侧旋转[13]，先使大鼠适应测试环境5 min，再用计算机自动测试系统记录APO所诱发的大鼠旋转行为，记录开始旋转至30 min内的旋转圈数，以向左侧（损伤侧）旋转圈数与向右侧（健侧）旋转圈数的差值在30 min内的平均数为净旋转圈数，且净旋转圈数>80 r・h-1，则视为成功模型。
1.6行为学检测 分别于大鼠给药后第3周和第6周以皮下注射APO 0.5 mg・kg-1诱发各组大鼠向健侧旋转，记录开始旋转至30 min内的旋转圈数。分别于给药后第3，6周进行大鼠转棒行为观察。测试前1周每天将大鼠在8 r・min-1的转速下训练3次，每次5 min，2次训练之间间隔20 min作为疲劳恢复时间。测试当天，将大鼠放在转棒上，启动转棒，开始计时，大鼠为保持平衡而跟随转棒运动，逐渐增加转棒转速，观察大鼠运动，直至大鼠从转棒上掉落，结束计时。
1.7TH免疫组化染色 各组大鼠麻醉后经心脏灌流固定，断头取脑，经冰冻切片，进行免疫组化染色（ABC法）。切片入0.3% Triton X-100透膜30 min；3% H2O2封闭内源性过氧化物酶；正常羊血清封闭30 min；TH一抗4 ℃孵育过夜；生物素标记羊抗小鼠二抗，室温孵育2 h；辣根酶标记的链霉卵白素，室温孵育30 min，37 ℃ 孵育30 min。以上各步骤均用 0.01 mol・L-1 PBS洗5 min×3。最后用DAB显色。常规脱水、透明、封片。每只大鼠各取纹状体、黑质相同部位脑片3张，通过Nikon显微镜采集图像，用NIS-Elements 病理图像分析系统（Ver.2.1）进行分析，根据灰度值选取TH阳性细胞和TH阳性纤维，计算黑质区域TH阳性细胞数目和纹状体区域TH阳性纤维密度值。
1.8脑组织各生化指标的测定 大鼠断头后迅速取脑组织，分离双侧纹状体及中脑腹侧组织，准确称取质量，用0.9%的生理盐水制成10%的组织匀浆，2 500 r・min-1离心取上清，分装后置于-80 ℃ 冻存。采用生物化学法检测 SOD，CAT，GSH-Px，NOS活性以及MDA，GSH，NO含量。以上测定均严格按照试剂盒说明书进行测定。
1.9统计学处理 采用SPSS 19.0软件，数据以±s表示，采用One-Way ANOVA分析各组间差异，P
2结果
2.1荜茇总生物碱对APO诱导旋转行为的影响 术后5周，经APO诱导后，假手术组大鼠无明显旋转现象，模型组大鼠存在异常旋转行为，旋转圈数与假手术组相比明显增多（P
2.2荜茇总生物碱对大鼠转棒行为的影响 术后5周，假手术组大鼠在转棒上的滞留时间为（65.0±4.1） s，模型组大鼠平衡协调运动功能较差，在转棒上的滞留时间明显比假手术组短（P
2.3荜茇总生物碱对PD大鼠脑组织内TH表达的影响 与假手术组相比，模型组黑质部位TH阳性细胞明显减少（P
2.4荜茇总生物碱对PD大鼠脑组织内SOD，GSH-Px，CAT，NOS活性和MDA，GSH，NO含量的影响 与假手术组相比，模型组大鼠损伤侧纹状体和黑质的SOD，CAT，GSH-Px活性明显降低（P
3讨论
帕金森病是一种多病因、多发病机制的老年退行性疾病，目前认为PD的发病可能与氧化应激、线粒体功能障碍、炎症反应、兴奋性氨基酸毒性、细胞凋亡、神经营养因子的下调、蛋白质异常折叠和集聚、钙平衡紊乱等多种因素有关[14]。其中，氧化应激是帕金森病发病的核心因素[15]，抗氧化治疗成为治疗帕金森病确实有效的方案之一[16]。荜茇具有广泛的药理活性和较强的抗氧化能力[17]。鉴于PD发病机制复杂，而中药有效部位的多成分具有协同作用和整体调节等优势，本实验选择含有多种酰胺类生物碱的荜茇总生物碱有效部位作为研究对象，考察其对6-OHDA致大鼠PD模型损伤的DA能神经元的保护作用，并从抗氧化作用来探讨其可能的保护机制。
在大鼠的行为学评价方面，通过外周给予DA受体激动剂APO可诱发大鼠向健侧产生旋转行为，记录一定时间内APO诱导的旋转次数，可以对PD的损伤程度进行量化，作为判断模型成功与否以及药物治疗作用的标准[18]。本实验结果表明，采用脑立体定位注射6-OHDA制备纹状体单侧毁损的PD大鼠，在APO诱导后出现明显的旋转行为，且在转棒上的滞留时间缩短，该行为与大鼠黑质TH阳性神经元的损伤以及纹状体内DA含量的减少程度有关[19]。通过TH免疫组化染色显示了PD大鼠模型中脑黑质TH阳性细胞及纹状体中TH阳性纤维表达减少，证明6-OHDA单侧纹状体注射造成大鼠黑质大量DA能神经元脱失，因而经黑质-纹状体通路投射到纹状体的DA神经递质减少。这一结果与行为学结果一致。PLA干预6周后，则能明显改善PD大鼠的行为异常，增加黑质区TH阳性细胞数及纹状体TH阳性纤维密度，从而推测PLA对DA神经元具有一定保护作用。
研究表明氧化应激和自由基损伤在PD的发病和发展过程中起着重要的作用，正常生物体内存在着SOD，GSH-Px，CAT和GSH等抗氧化酶及非酶系统，在整个防御体制中，SOD歧化氧阴离子（O2-）为过氧化氢（H2O2），CAT催化分解H2O2为水（H2O）和氧（O2），GSH-Px利用GSH还原H2O2为H2O或醇类化合物，它们相互协调，通过抗氧化以及清除多余的自由基对机体起保护作用[20-21]。而6-OHDA诱导的PD模型处于氧化应激状态，抗氧化保护系统SOD，GSH-Px，CAT和GSH等功能异常，导致氧化应激反应增强，氧自由基增多，引起过氧化脂质产物MDA的含量明显升高[22-23]。而NO作为氧自由基的一种，其神经毒性在PD的发病中起着重要作用，在病理状态下，NOS过量表达和NO含量升高，致使机体内过氧亚硝基的生成增多，从而诱导细胞的凋亡[24]。本实验结果表明，6-OHDA诱导的PD大鼠黑质及纹状体内SOD，GSH-Px，CAT的活力降低，NOS的表达升高，MDA和NO含量升高，GSH的含量降低，说明模型动物的抗氧化能力降低。而PLA干预后，提高了大鼠黑质及纹状体内的SOD，GSH-Px，CAT的活力，降低NOS的表达及MDA和NO的含量，升高GSH的含量，表明PLA能提高6-OHDA诱导的PD大鼠抗氧化能力。
综上所述，经过荜茇总生物碱治疗后，PD大鼠的神经元受损得到一定的修复，行为得到明显改善，而机体抗氧化能力也明显提高，说明荜茇总生物碱对6-OHDA诱导的PD大鼠具有神经保护作用，并且这种保护作用可能与PLA的抗氧化作用有关。
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Protective effect of alkaloids from Piper longum in rat dopaminergic
neuron injury of 6-OHDA-induced Parkinson′s disease
ZHENG Li1， WANG Hao2， BA Yin-ying1， LIU Hao-long1， WANG Meng1， GUO Wei-wei1， WU Xia1*， YANG Hui2
（1. School of Traditional Chinese Medicine， Capital Medical University， Beijing 100069， China；
2. Beijing Institute of Neural Science， Capital Medical University， Beijing 100069， China）
[Abstract] Objective： To discuss the protective effect of alkaloids from Piper longum（PLA） in rat dopaminergic neuron injury of 6-OHDA-induced Parkinson′s disease and its possible mechanism. Method： The rat PD model was established by injecting 6-OHDA into the unilateral striatum with a brain solid positioner. The PD rats were divided into the PLA group （50 mg・kg-1・d-1）， the madorpa group （50 mg・kg-1・d-1） and the model group， with 15 rats in each group. All of the rats were orally given drugs once a day for 6 weeks. Meanwhile， other 15 rats were randomly selected as the sham operation group， and only injected with normal saline in the unilateral striatum. The behavioral changes were observed with the apomorphine （APO）-induced rotation and rotary rod tests. The number of tyrosine hydroxylase （TH）-positive cells in rat substantia nigra and the density of TH-positive fibers in striatum were detected by tyrosine hydroxylase immunohistochemistry. The content of superoxide dismutase （SOD）， glutathione peroxidase （GSH-Px）， glutathione （GSH）， catalase （CAT）， malondialdehyde （MDA）， nitric oxide （NO） and nitric oxide synthase （NOS） in rat substantia nigra and striatum were measured by the spectrophotometric method. Result： After being induced by APO， PD rats showed obvious rotation behaviors， with decreased time stay on rotary rod and significant reduction in the number of TH-positive cells in sustantia nigra and the density of TH-positive fibers in striatum. The activities of SOD， GSH-Px， CAT， the content of GSH and the total antioxidant capacity significantly decreased， whereas the activities of NOS and the content of MDA， NO significantly increased. PLA could significantly improve the behavioral abnormality of PD rats and increase the number of TH-positive cells in sustantia nigra and the density of TH-positive fibers in striatum. It could up-regulate the activities of SOD， GSH-Px， CAT， the content of GSH and the total antioxidant capacity， and decrease the content of NOS and the content of MDA， NO. Conclusion： Alkaloids from P. longum shows the protective effect in substantia nigra cells of 6-OHDA-induced PD model rats. Its mechanism may be related with their antioxidant activity.
[Key words] Parkinson′s disease； Piper longum； alkaloid； 6-hydroxydopamine； antioxidant
doi：10.4268/cjcmm20140923