滇龙胆甲羟戊酸激酶基因的克隆与表达分析

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摘 要：甲羟戊酸激酶是甲羟戊酸途径的关键酶。根据滇龙胆转录组甲羟戊酸激酶基因GrMK序列，设计一对基因特异性引物克隆该

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1.2.4 GrMK基因的实时定量分析

分别取3年生滇龙胆的根、茎和叶，提取总RNA，使用DNase I处理除去基因组DNA。使用反转录试剂盒（Takara，大连）合成第一链cDNA。以转录组中Gr GA PDH基因（GenBank登录号KM061807）作为内参设计引物GrGAPDH―F和GrGAPDH-R（表1），PCR反应条件为：95 0C 3 min，95 0C 15 s，60 0C 31 s。根据GrMK基因的ORF序列设计特异性引物GrMK-F和GrMK-R（表1）。使用SuperReal PreMix Plus试剂盒（天根，北京）进行qPCR，PCR反应条件为：95 0C 3 min，95 0C15 s，60 0C 31 s。每个反应重复3次。反应在ABI7000荧光定量PCR仪（Applied Biosystems，USA）上进行扩增，扩增曲线、溶解曲线、标准曲线由定量PCR仪软件自动生成。使用内参基因Gr GA PDH表达校准后，计算根茎叶中GrMK基因相对表达量。采用比较Ct值的“2-Ana'’的方法进行定量数据的分析处理。

2结果与分析

2.1滇龙胆GrMK基因的克隆

以滇龙胆幼叶cDNA为模板，使用特异性引物GrMKBamH I-F和GrMKXho I-R扩增出约1 200 bp的片段。通过TA克隆获得重组质粒pMD19-GrMK。

2.2 GrMK基因的生物信息学分析

利用Genetyx和DNAMAN软件对GrMK基因序列进行分析，结果显示GrMK基因ORF为1 138 bp，编码387个氨基酸。将该序列上传至GenBank数据库，获得登录号KJ917167。

使用GenBank数据库BLASTp程序对GrMK蛋白进行相似性分析，结果表明滇龙胆GrMK与长春花CrMK蛋白序列相似性最高（85.79%），与拟南芥AtMK （67.29%）蛋白相似性较低。利用DNAMAN 7将GrMK蛋白氨基酸序列与NCBI中相似性较高的部分序列进行多序列比对分析，结果表明GrMK蛋白与已知蛋白序列保守性较高（图1）。利用Mega 6.0将GrMK蛋白与NCBI中相似性较高的部分序列和文献已报道的部分序列进行系统发育分析，结果显示滇龙胆GrMK蛋白与长春花CrMK处于同一进化枝（图2），表明二者亲缘关系较近。

使用ProtParam tool对GrMK蛋白进行分析，结果表明GrMK蛋白单体相对分子质量41.12 kD，这与长春花CrMK单体40.50 kD和拟南芥AtMK单体40.70 kD大小相类似[5]；pI为5.34；带正电氨基酸残基（Arg+Lys）为30，带负电氨基酸残基（Asp+Glu） 为30， 化学方程式为：C1817H2936N476O562S21。不稳定指数为31.22，属于稳定蛋白；脂肪指数为100.57，总平均疏水性（ GRAVY）为0.21，为疏水蛋白。GrMK蛋白含有20种基本氨基酸，其中亮氨酸和丝氨酸含量最高，均为10.60c/0；其次是丙氨酸和甘氨酸，分别为9.00%和8.800/0；色氨酸含量最低，为1.00%。

利用SSpro方法对GrMK蛋白进行二级结构分析，结果表明该蛋白二级结构中d一螺旋（H）占40.830/0，无规则卷曲（C）占40.31010，延伸带（E）占18.860/0。利用Swiss-Model Workspace使用自动模式预测GrMK蛋白的三级结构，结果如图3，该模型以甲烷八叠球古菌甲羟戊酸激酶[4hacA]为模板，在第2-382氨基酸处建模，序列相似度为22.51%。使用InterPro在线工具对GrMK蛋白的保守结构域进行分析，结果表明GrMK蛋白包含5个保守结构域，它们分别为：甲羟戊酸激酶伴乳糖激酶结构域（7-31，136-158，193-212，330-347）、甲羟戊酸激酶结构域（6-384）、乳糖激酶/高丝氨酸激酶/甲羟戊酸激酶/磷酸甲羟戊酸激酶（ GHMP kinase）N端结构域（133-212）、GHMP激酶ATP结合结构域（13 8一149）和GHMP激酶C端结构域（294-350）。

利用SignalP 4.1服务器分析GrMK蛋白，未发现信号肽，表明该蛋白为非分泌型蛋白。利用TMHMM工具预测GrMK蛋白的跨膜螺旋区，结果表明GrMK蛋白不含有跨膜区域（图4），为非膜蛋白。使用CldoroP在线软件对叶绿体转运肽进行预测，结果表明GrMK蛋白不含叶绿体转运肽。使用WoLF PSORT软件进行亚细胞定位分析，结果为GrMK蛋白在细胞核、叶绿体和细胞质的定位系数分别为8.0、4.0和2.0，这与文献报道的MVA途径存在于细胞质中的结论相矛盾[3]。

对GrMK基因进行稀有密码子分析，结果表明GrMK基因中稀有密码子仅占0.78010，且无二联或三联稀有密码子连续出现的情况，因此可选用表达菌BL21或Rosetta （DE3）进行原核表达。

2.3 GrMK基因原核表达载体的构建

使用BamH I和Xho I双酶切质粒pGEX-4T-1-GrMK，可切出目的片段和载体（图5），表明Gr MK基因已成功插入载体pGEX-4T-l。

2.4 GrMK基因的原核表达

将重组质粒pGEX-4T-l-GrMK转化大肠杆菌Rosetta（ DE3）后，进行IPTG诱导表达。在37 0C、终浓度为1 mmol/L IPTG下，分别诱导表达Oh、2h、4h和6h后，提取细菌总蛋白进行SDS -PAGE分析。结果表明，与对照相比，pGEX-4T-l-GrMK转化菌经IPTG诱导后，在相对分子质量67.12 kD（含GST标签蛋白26.00 kD）左右有1条蛋白条带，并且随诱导时间增加其蛋白含量逐渐增加，表明重组质粒pGEX -4T-1-GrMK在大肠杆菌Rosetta（ DE3）中成功诱导表达了GrMK蛋白。当温度为37 0C、诱导时间为6h时，蛋白表达量最大（图6），可直接用于下一步的蛋白纯化。

2.5 GrMK基因的组织表达分析

取3年生滇龙胆的根、茎和叶，通过实时定量RT-PCR分析GrMK基因在不同组织中的表达情况。结果表明，GrMK基因在根中表达量最高，约是茎和叶的2倍和485倍；其次是茎，表达量最低的是叶（图7）。

3讨论

MVA途径能够为滇龙胆药效成分龙胆苦苷的生物合成提供前体物质。MK是MVA途径的第一个限速酶[6，11]，因此，滇龙胆中GrMK基因的表达情况直接或间接影响龙胆苦苷的生物合成。研究表明，植物中MK蛋白如三七PnMVKlc[11]、林烟草NsMKc[13]、杜仲ELIMK[1 2]均包含GHMP激酶N端、C端结构域和ATP结合结构域。本研究从滇龙胆幼叶中克隆了GrMK基因，蛋白序列比对分析结果表明GrMK蛋白属于MK家族蛋白，在其N端、中部和C端分别具有3个保守结构域：GHMP激酶N端结构域（133-212）、GHMP激酶ATP结合结构域（138-149）和GHMP激酶C端结构域（294-350）。这些结果表明所克隆基因为滇龙胆甲羟戊酸激酶基因。

基因编码蛋白的活性形式和亚细胞定位对蛋白功能执行都有很大影响。在生物界，MK活性蛋白以单体或二聚体的形式在体内起作用。在詹氏甲烷球菌中，MjMK单体蛋白为36.00 kD，而其活性形式为二聚体，相对分子质量为68.00 kD[19]；在长春花中，其蛋白单体和活性形式相对分子质量分别为40.50 kD和104.60 kD；在酿酒酵母中，其单体蛋白即为其活性形式，相对分子质量为40.80 kDc20]。在本研究中，GrMK单体相对分子质量为41.12 kD.其活性形式需要通过非变性SDS-PAGE进行进一步检测。在人类、拟南芥和长春花中，MK蛋白均定位于细胞质[3，8，21]。在本研究中，生物信息学分析结果表明GrMK蛋白定位于细胞核的可能性最大，这与三七PnMK蛋白预测结果一致[11]但该结果与其功能作用并不相符，需通过融合GFP标签进一步验证其亚细胞定位。在拟南芥整个发育过程中，AtMK基因在各个组织中均表达，但在根分生组织中表达量最高[22]。组织表达特异性检测结果表明，Gr MK基因在根中表达量最高，因此推测滇龙胆根部为MVA途径较为活跃，并为龙胆苦苷生物合成提供前体物质。滇龙胆用药部分为根，因为与叶和茎相比，根中龙胆苦苷含量最高[23]这也为上述假说提供了证据。

本研究为滇龙胆GrMK基因功能的解析奠定基础。下一步将对GrMK蛋白进行纯化和酶活分析，通过互补试验或过表达研究Gr MK基因功能，为龙胆苦苷生物合成途径及其调控机理的阐明奠定基础。