PM2.5对儿童骨髓基质细胞增殖及细胞
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【摘要】 目的：研究大气细颗粒物（pm2.5）对儿童骨髓基质细胞（BMSCs）增殖及细胞因子分泌的影响，探讨PM2.5对儿童骨髓造血微环境的影响。方法：采用不同浓度的PM2.5溶液染毒提取后培养的BMSCs，检测BMSCs增殖和粒细胞集落刺激因子（G-CSF）、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子
（GM-CSF）分泌量及mRNA表达水平。结果：随着PM2.5溶液浓度增加，BMSCs增殖逐渐增强，溶液浓度达到50μg/mL后BMSCs增殖水平逐渐下降，20μg/mL时试验组BMSCs的OD值各时间段均高于对照组，而100μg/mL时均低于对照组，两组比较差异均有统计学意义（P
【关键词】 大气细颗粒物； 骨髓基质细胞； 增殖； 细胞因子
【Abstract】 Objective：To observe the effects of ambient particulate matter （PM2.5） on the proliferation and secretion levels of cytokines of children’s bone marrow stromal cells （BMSCs） and to explore the effects of PM2.5 on children’s bone marrow hematopoietic microenvironment.Method：The collected BMSCs were exposed to different concentration of PM2.5 solutions.The proliferation of BMSCs and the secretion levels of G-CSF，
GM-CSF and mRNA were detected.Result：The BMSCs proliferation increased with the increase of concentration of PM2.5 solution，after 50μg/mL the proliferation of BMSCs level gradually decline.The proliferation of BMSCs level with concentration 20μg/mL of experimental group was significantly higher than control，while 100μg/mL
of experimental group was significantly lower than control group，the differences were statistically significant（P
【Key words】 Ambient particulate matter； Bone marrow stromal cells； Proliferation； Cytokines
First-author’s address：Guangdong Medical College，Zhanjiang 524001，China
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.19.002
PM2.5是指空气动力学直径小于2.5 μm的细颗粒物质，是我国雾霾天气频发的“罪魁祸首”。纳米特性赋予其强大的黏附性，极易吸附多环芳烃等有机污染物和重金属组成复合物，导致所有可能的化学毒性[1]。长期暴露于PM2.5中可引起呼吸系统、心血管系统、免疫系统、神经系统、泌尿生殖系统等多器官功能损害，增加心血管疾病的死亡率及肺癌的发生率，国际癌症研究署已将大气污染物定义为人类致癌物[2-7]。国外流行病学调查显示，儿童白血病的发生与出生后交通相关颗粒物的暴露有确切的联系[8]。白血病是由于造血干/祖细胞分化阻滞、凋亡障碍而使细胞停滞在不同的造血阶段并恶性增殖的一类造血干细胞克隆性疾病，骨髓基质细胞是起源于胚胎发育的间充质干细胞，和其分泌的细胞因子一起具有黏附造血干/祖细胞，并支持造血细胞增殖、分化、发育、成熟、迁移、定居、释放、凋亡，是造血微环境中重要组成成分，为血液系统恶性疾病的重要参与者[9]。本研究以健康儿童骨髓基质细胞（BMSCs）为研究对象，探讨PM2.5对BMSC增殖、细胞因子分泌的影响，为环境污染与血液系统疾病的发生发展关系提供理论基础。
1 资料与方法
1.1 一般资料 骨髓由广东医学院附属医院儿童医学中心血液组提供，试验选用2014年4月-2015年2月来本科体检后排除疾病的正常儿童骨髓。
1.2 主要试剂和仪器 高糖DMEM培养基、胎牛血清（南美血，HyClone公司），Cell Counting Kit-8（CCK-8试剂盒，碧云天生物技术研究所），细胞裂解液（广州化学试剂厂），ELISA试剂盒（eBioscience公司），RNA提取试剂盒，Real-time PCR试剂盒，反转录试剂盒（日本TAKALA公司），淋巴细胞分离液（天津灏洋生物），SNP1-PM10/PM2.5空气采样仪（美国AT公司），PM2.5重量分析纤维滤膜，超声震荡清洗仪，丹尼酶标仪（MK-3丹麦），EPLICSXL流式细胞仪（美国Coulter公司），LightCycler480Ⅱ全自动荧光定量PCR仪（瑞士罗氏），UVP凝胶自动成像系统、水平琼脂糖凝胶电泳仪（Bio-Rad公司），高速冷冻离心机（Eppendorf公司），Beckman Coulter DU（美国Beckman），520UV/Vis Spectrophotometer（Coulter公司）。
1.3 方法
1.3.1 PM2.5的采集和制备 选取湛江市广东医学院校门口（车流量大、污染较重）为采样点，应用智能TSP中流量采样器采集2014年3-8月的大气PM2.5于专用质量分析纤维滤纸上，洗脱、过滤，真空冷冻干燥成干粉，收集干粉于-20 ℃保存、备用。使用前采用倍比稀释的方法配成终浓度0μg/mL的PM2.5溶液备用为对照组，试验组为终浓度10、20、50、100、200μg/mL的PM2.5溶液备用。
1.3.2 骨髓基质细胞培养 无菌条件下，用肝素化的20 mL注射器从志愿者髂后上棘抽取3 mL骨髓，高糖DMEM培养基等比稀释后，加入淋巴细胞分离液。离心，吸取第二层环状乳白色的单核细胞，洗涤、离心、弃上清。用15%胎牛血清高糖DMEM液体培养基重悬细胞，至恒温培养箱中培养，换液1～2 d/次，待细胞长满85%～90%融合时，即予以1∶2～1∶3的比例进行传代处理。取2代培养细胞用流式细胞仪检测细胞抗原表达情况，鉴定BMSCs，试验选用第2～3代细胞作为实验对象。
1.3.3 CCK-8法检测骨髓基质细胞的增殖 收集生长状态良好的第3代BMSCs，恒温培养箱中培养24 h后，吸弃原有培养基换无血清的高糖DMEM培养基，培养12 h后弃上清。分组加入PM2.5，培养12、24、48 h后，CCK-8法检测细胞增殖。
1.3.4 ELISA法检测BMSCs细胞因子G-CSF、
GM-CSF分泌情况 分别检测24 h后各组细胞因子G-CSF、GM-CSF的分泌量。以标准品的浓度为纵坐标、标准孔及空白孔的OD值为横坐标，绘出标准曲线，计算出该标准曲线的回归方程，将样品的OD值代入方程式，计算出样品的浓度，即为样品的实际浓度。
1.3.5 RT-PCR法检测BMSCs细胞因子G-CSF、GM-CSF的mRNA表达水平 用RealTime-PCR法检测PM2.5作用于BMSCs 24 h后各组细胞因子G-CSF、GM-CSF的mRNA的表达水平。本试验根据Ct值，用Delta-deltaCt相对定量的分析方法对实验结果进行分析，ΔCt试验组=Ct实验目的基因-Ct实验内参；ΔCt对照组=Ct对照目的基因-Ct对照内参；ΔΔCt=ΔCt试验组-ΔCt对照组，最后计算2-ΔΔCt的结果作为统计数据，表明试验组和对照组的相对倍数关系，每个样本浓度设3平行。
1.4 统计学处理 使用SPSS 19.0统计软件进行分析，计量资料采用（x±s）表示，组间比较采用方差（LSD）分析，以P
2 结果
2.1 PM2.5对BMSCs增殖的影响 同一时间与对照组比较，试验组在10、20μg/mL浓度范围内，BMSCs增殖逐渐增强；50μg/mL后，BMSCs的增殖水平逐渐下降，两组比较差异均有统计学意义（P
2.2 PM2.5对BMSCs细胞因子G-CSF、GM-CSF分泌的影响 用不同浓度的PM2.5溶液作用于BMSC 24 h后，试验组10、20μg/mL的BMSCs分泌细胞因子G-CSF、GM-CSF增多，50、100、
200μg/mL的BMSCs细胞因子G-CSF、GM-CSF分泌减少；试验组中20μg/mL处理下的G-CSF、GM-CSF均高于对照组，而100μg/mL以上则低于对照组，两组比较差异均有统计学意义（P
2.3 对BMSCs细胞因子G-CSF、GM-CSF的mRNA表达水平的影响 用不同浓度的PM2.5作用于BMSCs 24 h后，与对照组比较，试验组低浓度PM2.5溶液促进BMSCs细胞因子G-CSF、GM-CSF的mRNA表达，高浓度抑制BMSCs细胞因子G-CSF、GM-CSF的mRNA表达。其中10、20μg/mL
处理下G-CSF、GM-CSF的mRNA相对表达量均高于对照组，而200μg/mL处理则显著低于对照组，两组比较差异均有统计学意义（P
3 讨论
郑灿军等[10]用PM2.5染毒原代培养的大鼠心肌细胞，发现其存活率随染毒浓度升高而上升，在10μg/mL时达到最高，随后随浓度的升高而降低，观察到PM2.5及其组分对心肌细胞的hormosis效应[11]。贾巧玉等[12]用不同质量浓度的PM2.5作用于人肺成纤维细胞后，也发现对细胞的增殖有双向刺激作用，即低浓度刺激、高浓度抑制的作用。本实验结果与其有相似之处，都是发现PM2.5低浓度对细胞存在正性效应，高浓度则是负性效应，这遵循大多数毒理学研究规律，即hormosis效应。低浓度PM2.5溶液促进BMSCs细胞因子G-CSF、
GM-CSF的分泌和mRNA表达，原因可能是低浓度的PM2.5在刺激BMSCs增殖后，短时间内BMSCs细胞数目增加，进而引起了细胞因子分泌的增加，也可能是G-CSF、GM-CSF等一系列因子分泌增加促进了BMSCs的增殖。GM-CSF被认为是一种与组织再生和/或修复有关的细胞因子，在体外能诱导集落形成，能够刺激DNA合成，与BMSCs表面受体结合后刺激细胞增殖[13-14]。G-CSF在对骨髓干细胞的动员过程中涉及到细胞生长因子、黏附分子和趋化因子的相互调节作用，并且通过改变骨髓干细胞与BMSCs之间的相互作用，从而影响造血干细胞的黏附、迁移和定居，研究证明G-CSF可动员造血干细胞从骨髓进入外周血，并能同时动员造血干细胞和基质细胞的能力[15]。
PM2.5低浓度刺激及高浓度抑制作用均能导致BMSCs增殖及其细胞因子分泌异常，不管何种作用，对骨髓造血微环境均产生影响，若是造血干细胞存在异常分化，长时间暴露于PM2.5中，可能促进细胞异常分化表达，成为恶性血液疾病的催化剂，尤其是高浓度的PM2.5对细胞毒性作用更大。PM2.5的毒性作用可能与其导致的氧化应激损害密切有关，PM2.5含有多种重金属及有毒有害物质，其多种成分具有氧化性，可以促使机体产生活性氧、活性氮和氧自由基，通过直接或间接作用激活靶细胞的氧化反应信号通路，从而最终引起各种生物效应[16]。其通过肺血屏障进入血液循环，激活细胞内氧化反应，触发多种信号转导途径，如P21Ras、P38MAPK、ERK-1/2MAPK、Smads/src激酶，引起细胞损伤，细胞因子分泌紊乱，最终造成细胞增殖、分化或死亡等不同结局[17]。相关研究报道通过气管滴注PM2.5染毒小鼠造模，证明PM2.5在动物体内可通过氧化应激反应抑制小鼠骨髓基质细胞增殖，可能与激活AKt信号通路有关，且通过对BMSCs抗氧化预处理可减少对BMSCs的增殖抑制，论证了PM2.5对骨髓的毒性作用[18]。敖当等[19]研究PM2.5对大鼠血管平滑肌细胞增殖及NO和内皮素分泌的影响，亦推测可能与PM2.5引起细胞氧化应激反应导致NF-κB等炎症因子异常增高有关。研究表明颗粒物的不同组分均对肺泡Ⅱ型上皮细胞（MLE-12细胞）活力具有显著的抑制作用，可显著升高胞内过氧化氢（H2O2）[20]。通过诱导人肺上皮A549细胞自噬相关蛋白Atg5和自噬基因Beclin1的mRNA表达诱导细胞自噬反应，可诱导胞外LDH释放和胞内ROS产生，且成时间―浓度依赖性[21]。正常情况下，造血干细胞主要定位于骨髓的低氧环境中，低氧环境限制了ROS的产生，使得造血干细胞能够免受长期的氧化损伤作用，保证正常的造血功能，一旦造血微环境低氧环境被破坏，必将影响造血干细胞正常的造血功能。
PM2.5作用于BMSCs后对其增殖、细胞因子分泌的影响，破坏了骨髓微环境平衡。研究表明高浓度影响更大，说明了PM2.5对BMSCs具有一定毒性，但其具体机制尚需进一步的研究。
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