转化人参皂苷Rg1的活性菌株鉴定
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摘要：筛选长白山人参土壤中的活性微生物，转化单体人参皂苷rg1。其中菌株EST-Ⅰ能将人参皂苷Rg1转化为稀有人参皂苷F1。结合菌落形态、产孢结构、孢子形态特征以及菌株ITS rDNA核酸序列分析，阳性菌株EST-Ⅰ被鉴定为平滑青霉Penicillium sclerotiorum。
关键词：人参皂苷Rg1；人参皂苷F1；平滑青霉；生物转化
【中图分类号】R927.2 【文献标识码】A 【文章编号】1674-7526（2012）12-0402-02
人参及其制品中的主要活性成份是人参皂苷，由于人参皂苷分子结构中糖基侧链的不同而显示出不同的性质和药理活性[1， 2]。前文主要报道了从人参根际土壤中分离得到的真菌可以将人参皂苷Rg1转化为稀有人参皂苷F1[3]，本文对活性真菌EST-Ⅰ的进行了菌种鉴定。
1 材料和方法
1. 1 材料
1. 1. 1 主要试剂和仪器：引物ITSl和ITS4由上海博亚生物技术公司合成；Taq DNA聚合酶、RNase A、DN段纯化试剂盒购自TaKaRa公司（大连）；其他试剂均为分析纯试剂。
1.1.2 培养基：①真菌分离用PDA培养基、种子培养基及液体转化培养基见文献[3]。②：真菌鉴定用察氏琼脂培养基（CA）、察氏酵母浸出物琼脂培养基（CYA）及麦芽汁琼脂培养基（MEA）参见文献[4]。
1.2 菌种鉴定
1.2.1 形态学鉴定：采用三点接种法将阳性菌株的孢子分别接种于培养基（CA、CYA、MEA和PDA）上，25℃倒置培养7 d后肉眼观察菌落特征，并采用插片培养法进行显微观察，依据参考文献[5-7]鉴定菌株的种属。
1.2.2 分子生物学鉴定：真菌染色体DNA的提取方法参见[8]。以ITSl（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’）和ITS4（5’-TCCTCCOCTTATTGATATGC-3’）为引物，PCR扩增ITS片段的反应采用50 μL体系，反应程序：95℃ 5 min；95℃ 1 min，40℃ 2 min，72℃ 3 min，5个循环；95℃ 1 min，53℃ 2 min，72℃ 3 min，25个循环；72℃ 5 min。0.7%琼脂糖凝胶电泳分析扩增结果。
2 菌种鉴定结果
2.1 形态学特征：菌落形态：在CA上，菌落质地呈黄色致密颗粒状，孢子绿色，中央呈黄色絮状突起，边缘白色，背面橙红色，边缘白色，菌丝无色（图略）。在CYA上，菌落质地呈黄色颗粒状，孢子绿色，致密，中央绿色突起，具皱褶，边缘菌丝白色，背面橙黄色，有同心轮纹，中央颜色深，呈放射状，边缘半透明白色菌丝，无渗泌物（图1-A）。在MEA上，菌落质地呈绿色致密绒状，中央白色絮状，边缘黄色，气生菌丝不繁茂，背面橙红色，中央微凹陷，边缘黄色（图略）。在PDA上，菌落致密绿色绒状，边缘黄色，气生菌丝不繁茂，背面橙红色，呈辐射状，边缘黄色，无渗泌物（图略）。菌丝体形态：直立分生孢子梗，分成很多的分生孢子梗，具横隔，光滑，孢子梗的上端产生对称或不对称的扫帚状的分枝，在小梗顶端着生成串的分生孢子，球形，光滑（图1-B，C）。
2.2 ITS-5.8S序列比对：通过PCR扩增后，得到片段大小为467 bp。通过Blast将所测得的序列与Genbank中的rDNA同源序列比对，从Genbank中获得较高同源性菌株的ITS-5.8S序列，从中选择4株ITS-5.8S序列同源的菌株，1） Penicillium sclerotiorum 2） Penicillium herquei 3） Penicillium adametzii，同源性均为98.1%。结合形态学观察培养特征，最终鉴定该真菌菌株为平滑青霉Penicillium sclerotiorum。
参考文献
[1] Chen X.， Zhou QL.， Wang BX. The metabolism of ginsenoside Rbl by intestinal Bacteda[J]. Acta Pharm. Sin. 1999， 34 （6）： 410-414
[2] 庄毅. 菌质一一个中药的新领域. 中药新药与临床药理 （Traditional Chinese Drug Research & Clinical Pharmacology）. 1992. 3 （2）： 49-51
[3] 吴秀丽， 张仪轩， 赵文倩， 王金辉， 吴春福， 李铣. 真菌EST-I及EST-Ⅱ对人参皂苷Rgl定向转化为人参皂苷F1的研究[J]. 沈阳药科大学学报， 2008， 25 （1）： 73-76
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[5] 魏景超. 真菌鉴定手册. 上海： 上海科学技术出版社， 1979
[6] 戴芳谰. 真菌的形态与分类. 北京： 科学出版社， 1987
[7] von Arx JA. The genera of fungi sporulating in pure culture[J]. Mycologia， 1975， 67 （4）： 892
[8] Joseph S.， David R. 分子克隆实验指南. 黄培堂 等译. 第三版. 北京： 科学出版社， 2002