地黄饮子对Aβ诱导的PC12细胞SODmRNA表达影响的研究

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摘要：目的 研究地黄饮子对β淀粉样蛋白（Aβ）诱导的pc12细胞sodmrna表达的影响。方法 通过实时荧光定量PCR法检测各组PC12细胞SODmRNA的表达。结果 与空白组比较，模型组相对定量基因表达升高（P

关键词:β淀粉样蛋白；老年性痴呆；地黄饮子

中图分类号：R743 R289.5 文献标识码：A 文章编号：1672-1349（2011）06-0704-03Effect of Dihuang Yinzi Decoction on Expression of SOD mRNA in PC12 Cells Induced by β-amyloid

Zhou Yanyan,Yao Xinmin,He Xiuli,et al // Heilongjian University of Traditional Chinese Medicine （Harbin 150040）

Abstract:Objective To observe the protective effect of Dihuang Yinzi decoction （DYD） on superoxide dismutase （SOD） mRNA in PC12 cells induced by β-amyloid.Methods The expression of SOD mRNA was assayed by real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction （FQ-PCR）.ResultsThe expression of SOD mRNA in PC12 induced by β-amyloid 25-35 was significantly higher than that in control group（P

Key words:β-amyloidAlzheimer’s diseaseDihuang Yinzi decoctionsuperoxide dismutase

1） 为国家自然科学基金项目（No.30772719），黑龙江省自然科学基金项目（No.D201014）

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）是一种以进行性记忆障碍和智能衰退为主要临床特征的中枢神经系统退行性疾病【sup】［1］【/sup】。随着人们生活水平的提高及医学技术的进步，人类的寿命进一步延长，人类社会逐步进入老龄化社会。随着年龄的增长，AD的发生率呈上升趋势。基于AD发病的复杂背景，作用于单一靶位的药物效果不够理想。复方中药包含多种化学成分，作用于多靶位而可能收到良好效果。因此，立足于中医药理论寻求防治AD的有效方药意义重大。本研究采用脑脊液药理学方法，进一步探讨了地黄饮子防治AD的作用机制，为研制开发有效治疗AD的药物奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料与仪器 PC12 细胞株，中国科学院上海细胞生物研究所；大耳白家兔，黑龙江中医药大学实验动物中心；地黄饮子，由熟地、山萸肉、肉苁蓉、巴戟天等组成；盐酸多奈哌齐片（商品名安理申），法国PFIZER PGM公司；ExScript TMRT reagent kit（Perfect Real Time）053S，宝生物工程（大连）有限公司；PCR System扩增仪2700型，Applied Biosystems；Real Time PCR System，7300型，美国ABI公司。

1.2 实验方法

1.2.1 PC12细胞的培养方法 PC12 细胞培养于含10% 胎牛血清DMEM的培养液中，并加入100 U/mL链霉素，100 U/mL青霉素。在37 ℃，5%CO【sub】2【/sub】/95%空气，饱和湿度的培养箱中培养。2 d换液1次，3 d、4 d传代1次，取对数生长期细胞用于实验【sup】［2，3］【/sup】。

1.2.2 中药脑脊液的提取方法 2 kg体重大耳白家兔30只，适应性喂养3 d，予地黄饮子水煎剂、安理申水溶液灌胃，灌服药量均按成人量10倍给药，其余家兔予等体积的蒸馏水。灌胃后1 h，戊巴比妥钠静脉麻醉，于无菌条件下在枕骨大孔处垂直进针，抽取200 μL脑脊液，并补充等量的生理盐水，以上步骤连续3 d，把3 d获得的同一家兔的脑脊液混合，－70 ℃冻存备用。

1.2.3 实验分组及AD细胞模型的建立 离体培养的PC12细胞分为空白组、模型组、安理申组、地黄饮子低剂量组、地黄饮子中剂量组、地黄饮子高剂量组。将细胞以2×10【sup】4【/sup】/mL密度接种于培养瓶中，待细胞进入对数生长期后吸去培养液，分别加入空白培养液10%、正常脑脊液10%、安理申脑脊液10%及中药脑脊液低剂量5%、中剂量10%、高剂量20%。加培养液补至等量，37 ℃孵育2 h。然后除空白组之外的各组加入经老化处理的Aβ25-35（终浓度为10 μmol/L），建立AD细胞模型，空白组加入等量的培养液。继续孵育24 h后进行指标检测。

1.2.4 实时荧光定量PCR法检测PC12细胞SODmRNA表达

1.2.4.1 RNA的提取及检测 采用Trizol试剂盒提取PC12细胞总RNA，并应用紫外分光光度分析和琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的纯度、含量及完整性。

1.2.4.2 逆转录反应 逆转录反应在2700型PCR System扩增仪上按SYBR ExScript【sup】TM【/sup】RT-PCR kit反转录试剂说明书进行cDNA合成。反应参数为42 ℃ 15 min，反转录酶的失活反应95 ℃ 2 min。

1.2.4.3 PCR反应 PCR反应应用SYBR Premin ExTap（Perfect Real Time）Kit试剂在ABI7300荧光定量PCR仪上进行PCR反应。引物由大连宝生物公司设计和合成；反应条件：第一步是预变性，95 ℃预变性10 s，共1个循环；第二步是PCR反应，95 ℃变性5 s，60 ℃退火31 s，共40个循环。引物序列以及引物特异性介导扩增的PCR产物大小详见表1。

表1 引物序列以及引物特异性介导扩增的PCR产物大小

1.2.4.4 结果分析 每个样本作2个复孔，实验重复5次。反应结束后，使用Sequence Detection software version 1.2.3软件（Applied Biosystems公司）分析PCR过程各检测样本的CT（Threshold cycle）值。CT值的含义是每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。每个模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，CT值越小。本研究通过2【sup】-CT【/sup】计算SOD相对mRNA表达水平，CT【sub】【/sub】interventionCT【sub】【/sub】intervention SOD-CT【sub】【/sub】intervention GAPDH，CT【sub】blank【/sub】CT【sub】【/sub】blank SOD-CT【sub】【/sub】blank GAPDH，CTCT【sub】【/sub】intervention-CT【sub】blank【/sub】，SOD mRNA表达差别倍数以2【sup】-CT【/sup】表示。由熔解曲线判断PCR反应的特异性。

1.3 统计学处理 数据用均数±标准差（x±s）表示，数据统计分析均在SPSS11.0软件中进行，采用方差分析，多组间两两比较用LSD法。

2 结 果

2.1 产物鉴定 SOD、GAPDH的熔解曲线中均有单一的主峰，熔解温度分别为82.0 ℃和86.7 ℃，相同扩增条件下重复多次，得到的 SOD、GAPDH熔解温度均分别在82.0 ℃、86.7 ℃左右，上下不超过 1 ℃，说明所扩增的为特异性产物（见图1、图2）。扩增产物经2%琼脂糖电泳，紫外线下扫描分析，符合设计的片断长度（见图3）。

图1 PC12细胞 SOD荧光定量 PCR 熔解曲线

图2 PC12细胞 GAPDH荧光定量 PCR 熔解曲线

图3 荧光定量PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图

2.2.2 【sup】-CT【/sup】法可行性分析 要使2【sup】-CT【/sup】法计算方法有效，目的基因与管家基因的扩增效率必须相等。对不同稀释度模板分别进行目的基因和管家基因扩增，得出一条以模板稀释度的对数值为横坐标，以CT为纵坐标的直线，如果该线的斜率接近于0，说明在反应体系中，目的基因与管家基因的扩增效率接近，也就是说，可以使用2【sup】-CT【/sup】法作为相对定量的分析方法。本研究中，浓度梯度线的斜率为0.0532（Y0.053 2logX+1.981），并且目的基因与管家基因扩增曲线平行，说明可使用2【sup】-CT【/sup】方法对目的基因进行相对定量。

2.3 地黄饮子对PC12细胞SODmRNA表达的影响（见表4、图4） 与空白组（差别倍数为2【sup】0【/sup】1）比较，模型组相对定量基因表达升高（P

表4 各组细胞SODmRNA表达比较（x±s）

图4 PC12细胞 SOD荧光定量 PCR 扩增曲线

3 讨 论

AD的病位在脑，其病机以本虚标实为特征。本虚主要在于肾精不足，髓海亏虚，清阳不升【sup】［4］【/sup】。人至老年，肾虚精不生髓，髓海空虚则脑神失用，神衰智力失聪终致痴呆。所以说随年龄的增长而发生的肾虚精亏、髓海不足是AD发生的最基本的病机；标实在于痰浊、瘀血蒙蔽脑窍，闭阻脑络。一方面肾虚为主的五脏虚衰可导致痰浊的产生，此所谓因虚而致实；另一方面，痰浊为患又可影响气血津液的化生和运行，致本虚更甚，即因实而致虚。两者互为因果，形成恶性循环，以致病程缠绵，见症多端。故诸多医家认为随年龄的增长而发生的肾精亏虚为主的五脏虚衰是AD发生的内在机制，兼挟痰瘀是加速衰老导致老年性痴呆发生的重要因素。

地黄饮子出自刘完素的《黄帝素问宣明论方》，具有“滋肾阴、补肾阳、开窍化痰”之功，本方符合AD本虚标实的病机特点。临床报道该方治疗中风、脑萎缩、血管性痴呆、运动神经元病等脑病有较好的疗效，对神经系统具有较好的保护作用。我们前期的研究表明，地黄饮子对多种AD模型大鼠的学习记忆功能、胆碱能系统、氧化反应、细胞凋亡、神经元的炎症损伤、脑组织能量代谢等方面均有明显作用，体现了该方防治AD的良好前景。

由于中药复方原有成分在体内或转化成活性成分，或代谢后失活，或没有被机体吸收，或通过诱导机体内源性成分间接起作用，这使得中药复方的研究趋于困难。但由于化学成分或生物活性成分通过血脑屏障的数量有限，脑脊液药理学的方法则可以简化这种研究过程。脑脊液药理学排除了体外实验的各种干扰因素，既可反映出中药复方及其代谢产物的药理作用，又可反映出药物诱导机体产生的内源性成分的作用，较接近药物在体内的生物转化的真实过程，更具有科学性、真实性【sup】［5］【/sup】。脑脊液药理学还解决了中药大分子能否通过血脑屏障的问题，为探讨中药复方对中枢神经系统的作用提供了一条不可替代的途径。

β淀粉样蛋白（β-amyloid protein,Aβ）的沉积在阿尔茨海默病发病上起关键作用【sup】［6］【/sup】,纤维状沉积的Aβ是SP的主要成分，是AD的重要病理学特征，也是各种原因诱发AD的共同通路，在AD的发生、发展中起着关键作用【sup】［7］【/sup】。氧化应激是实现Aβ神经毒性的途径之一，而氧自由基能促进Aβ的聚积,使其在脑内过度活跃,导致神经元退行性变而发生AD。SOD是机体内天然的氧自由基清除剂，是一种含金属抗氧化酶，是清除自由基酶系统中的较重要的酶类，SOD对机体的氧化与抗氧化平衡起着重要作用，是衡量机体抗氧化能力的重要标志酶。

本研究结果表明，地黄饮子能提高Aβ诱导的PC12细胞SODmRNA的表达，提高抗氧化能力，较好地拮抗自由基损伤，从而起到防治AD的作用。

参考文献：

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作者简介:周妍妍（1977―），女，副教授，博士，在站博士后，现工作于鸡西矿业集团总医院博士后工作站、黑龙江中医药大学（邮编：150040）；姚辛敏、何秀丽、谢宁（通讯作者），工作于黑龙江中医药大学（邮编：150040）。

（收稿日期：2011-01-11）