军牧一号白猪肉质主效基因多态性及其与初生重和断奶重的相关分析

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摘要：氟烷、酸肉及心脏脂肪酸基因是猪的三个重要的肉质基因，对猪的肉质和生产性状具有很大的影响，为探索氟烷、酸肉及心脏脂肪酸基因与仔猪初生重和断奶重之间的关系，本研究采用PCR-RFLP的方法对军牧一号白猪氟烷、酸肉及心脏脂肪酸基因多态性进行了检测，通过对突变位点和初生重以及断奶重的关系进行分析，结果显示：氟烷基因NN基因型的初生重显著高于Nn型，各基因型断奶重间差异均不显著。

关键词：军牧一号白猪；氟烷基因；酸肉基因；心脏脂肪酸基因；初生重；断奶重

中图分类号：S858.28 文献标识码：A 文章编号：1674-0432（2010）-09-0228-3

0 前言

军牧一号白猪由中国人民军需大学(现为吉林大学农学部)1998年利用杂交育种原理，将父本比利时施格猪的臀部特别突出性状与母本三江白猪的繁殖性能好、适应性强等优良性状有机结合，通过继代选育方式，横交固定，自群繁育5个世代培育成的瘦肉型猪[1]。具有生长快、饲料利用率高、胴体瘦肉率高、抗逆性能强等特点，尤其适合北方寒冷地区饲养[2]。氟烷、酸肉和心脏脂肪酸基因是三个与肉质相关的主效基因，其多态性分别与猪应激综合征(PSS)反应[3]、酸肉(acid meat)和肌间脂肪含量密切相关。采用PCR-RFLP技术，分析了氟烷基因、酸肉基因和心脏脂肪酸基因共5个多态性位点的多态性，并将其结果与军牧一号白猪的初生重和断奶重进行了相关性分析，为探索这三个肉质基因与猪初生重和早期生长性状的关系提供了一定参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 样本 实验选用吉林大学原种猪场的军牧一号白猪59头。

1.1.2 试剂 组织基因组DNA提取试剂盒（V-gene公司生产），Taq DNA聚合酶（宝泰克公司生产），限制性内切酶、DNA Marker、dNTPs、引物购自宝生物工程有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 组织DNA的提取 仔猪打耳号时收集耳组织样本，存于75%乙醇溶液中，-20℃保存，用组织基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA。

1.2.2 PCR的扩增

（1）引物参考伍少钦[4]、梁全顺[5] 、高妍[6]等设计的引物，具体引物信息如下：

氟烷基因：上游引物：5’-TCCAGTTTGCCACAGGTCCTACCA-3’

下游引物：5’-ATTCACCGGAGTGGAGTCTCTGAG-3’

片段长度：659bp

退火温度：61℃

酸肉基因：上游引物：5’-GAGGCCCAAATAAGTCAATGTA-3’

下游引物：5’-ACCGGGGTCAAATGCTC-3’

片段长度：616bp

退火温度：62℃

心脏脂肪酸基因：上游引物：5’-GGACCCAAGATGCCTACGCCG-3’

（5’-上游区） 下游引物：5’-CTGCAGCTTTGACCAAGAGG-3’

片段长度：693bp

退火温度：59℃

心脏脂肪酸基因：上游引物：5’-TTGCTTCGGTGTGTTTGAG-3’

（第二内含子区）下游引物：5’-CAGGAATGGGAGTTATTGG-3’

片段长度：816bp

退火温度：63℃

（2）PCR反应体系：DNA模板1μl，上游引物0.5μl，下游引物0.5μl，TaqDNA聚合酶0.5μl，Taq Buffer2.5μl，DNTP2.5μl，去离子水17.5μl。

反应条件：预变性94℃5分钟，变性94℃35秒，退火温度参照引物退火温度，35秒，延伸72℃35秒，35个循环，再延伸72℃10分钟。

1.2.3 酶切反应 共选用Alw211、BsrBI、Hinf I、HaeIII和MspI 5种限制性内切酶。氟烷基因的PCR扩增产物使用Alw211进行酶切；酸肉基因的扩增产物使用BsrBI酶切；脂肪酸基因5’-上游区的扩增产物使用Hinf I酶切；脂肪酸基因第二内含子区的扩增产物使用HaeIII和MspI分别进行酶切。酶切反应体系为10μl，其中PCR产物5μl，限制性内切酶0.5μl，酶切条件为37℃，8小时。

1.2.4 性状测定 对军牧一号白猪仔猪的初生重和断奶重进行测定。

1.2.5 数据的统计处理 对测得的基因型进行计数，统计基因频率和基因型频率，并对多态位点的基因型频率分布进行Hardy-Weinberg平衡检验，使用SPSS13.0软件计算各基因型的初生重和断奶重的最小二乘均值和标志误，对各基因型的初生重和断奶重进行正交设计方差分析，分析各基因型与初生重和断奶重之间的关系。

2 结果

2.1 氟烷、酸肉和心脏脂肪酸基因目的片段扩增结果

PCR扩增后，所得产物用1%琼脂糖凝胶电泳(Marker为 DL2000)，所得部分电泳图如下（图1），分子量大小与预期结果相同。

图1 H-FABP 5’-上游区扩增结果

2.2 限制性内切酶酶切结果

根据上述酶切体系对四个PCR的目的片段进行酶切，所得产物用2.5%琼脂糖凝胶电泳(Marker为 DL2000)，当氟烷基因未突变时，Alw211可将659bp的PCR扩增产物酶切成大小分别为493bp和166bp两个片段，电泳可见493bp和166bp两条带，基因型为NN；氟烷基因2条DNA链均发生突变时，Alw211无法识别酶切位点，659bp的扩增片段不能被酶切，电泳后只有1条659bp的条带，基因型为nn；氟烷基因只有一条DNA链发生突变时，一条DNA链可以被酶切，而另一条则无法被内切酶识别，因此电泳可发现片段长度为659bp、493bp和166bp的3条带，基因型为Nn（如图2）。

注：泳道1、2、4、8、9为NN基因型，泳道3、5、6、7、10、11、12为Nn基因型。

同理，在使用Bsrb1酶切后，RN基因的完全突变型rn/rn会被酶完全切开，电泳可看到426bp和190bp两条带；若一条链突变即Rn/rn基因型则被酶切开一条，出现616bp、426bp和190bp三条带；野生型即RN/RN基因型则完全不能被酶切，只形成616bp的条带(如图3)。

注：泳道1－8全部为rn/rn基因型。

H-FABP基因5’-上游区出扩增片段采用HinfI酶切,当不发生突变时，各个酶切位点完全被酶切开，产生了片段长度为339、172、98、59、25bp的5个片段，基因型为HH；若第1321位点突变，则酶切片段长度为339bp，231bp，98bp和25bp，基因型为hh（如图4）。

H-FABP基因第二内含子区有两个酶切位点，其中HaeⅢ酶切位点的等位基因分别为D型和d型，D型酶切片段为683bp，117bp和16bp；d型酶切片段为405bp、278bp、117bp和16bp（如图5）；MspI酶切位点等位基因为A型和a型，A型酶切片段有750bp和66bp，a型酶切片段为816bp（如图6）。

2.3 军牧一号白猪氟烷、酸肉和心脏脂肪酸基因频率和基因型频率分布情况（如表1-5）

2.4 不同基因不同基因型对初生重和断奶重的关系

各个多态位点不同基因型与初生重和早期生长性状最小二乘均值差异显著性检验结果见表6-表8。正交设计方差分析结果显示氟烷基因NN基因型和Nn基因型间初生重差异显著（0.01＜P＜0.05）,NN基因型的初生重显著高于Nn型，各基因型断奶重间差异均不显著。

3 讨论

氟烷、酸肉及心脏脂肪酸基因是三个重要的肉质基因。也是猪DNA标记辅助选择（MAS）育种中的主要DNA标记[7]。在本研究中，氟烷基因NN、Nn频率分别为0.6441和0.3559，N和n等位基因的频率分别为0.8220和0.1780。经X2检验，P＞0.05差异不显著。表明氟烷基因在军牧1号猪种中Hardy-Weinberg遗传平衡。氟烷基因的隐形纯合子会导致猪的应急综合症，但同时对几乎所有的胴体性状均具正效应。而氟烷基因对于猪的繁殖性状的影响，却得出了不同结果，蒋思文[8] (1996)的报道，nn型猪在繁殖性能的表现较差，丁能水等[9] (1999) 的研究结果表明Nn型的窝产仔总数、窝产活仔数、初生重、60日龄成活头数、60日龄窝重均略高于NN型;刘海峰等[10](2003)的研究发现，Nn型在窝产活仔数、20日龄个体重、35日龄断奶个体重等稍搞于NN型；而窝产仔总数、20日龄成活率等却稍低于NN型，而初生重和断奶重NN基因型和Nn基因型差异不大。本实验结果显示，NN基因型的猪初生重显著高于Nn基因型，而断奶重两者则差异不大，与刘海峰的研究结果有差异，其原因可能是由于受实验猪群较小、品种及猪场环境等的影响。

酸肉基因BrsBI酶切位点的多态性检测结果显示59头被检的军牧1号白猪基因型均为rn/rn ，说明在长期的育种过程中，RN基因已经受到了人为定向的淘汰。因此在本研究中无法判断酸肉基因多态性与仔猪初生重和断奶重之间的关系。

本研究中在心脏脂肪酸基因5’-上游区的Hinf I酶切位点存在多态性，HH基因型频率和Hh基因型频率分别为0.5763和0.4237，在本研究中心脏脂肪酸基因HH基因型和Hh基因型在仔猪初生重和断奶重之间差异不大。在心脏脂肪酸基因第二内含子区的HaeⅢ酶切位点上，存在DD、Dd和dd三种基因型，其基因频率分别为0.2542、0.5424和0.2034，D和d等位基因的频率分别为0.5254和0.4746。经X2检验显示基因频率和基因型频率均处于Hardy-Weinberg平衡状态(P＞0.05)。本研究中发现dd基因型的初生重和断奶重略高于DD和Dd基因型，但差异不显著。本研究中心脏脂肪酸基因第二内含子区的Msp I酶切位点上未发现多态性，因此无法判断MspI酶切位点多态性与仔猪初生重和断奶重的关系。

参考文献

[1] 张晶.忆“军牧1号白猪”培育的故事[J].猪业科学, 2007，(3):90-93.

[2] 侯万文.瘦肉型新品系猪-军牧1号[J].吉林畜牧兽医, 1997,5:22.

[3] Fujii J, Otsu K, Zorzato F, et al. Identifcation of a mutation in porcine ryanodine receptor associated with m alignant hyperthermia[J].Science.1991,253 :448-451.

[4]伍少钦,唐荣福，等.PCR-RFLP方法检测猪的氟烷基因[J].广西畜牧兽医,2007,23(5):214-216.

[5] 梁全顺,沈华伟等.应用PCR- RFLP及PCR- SSCP技术检测猪RN基因的研究[J].福建畜牧兽医，2005,27(2):5-6.

[6] 高妍,肖书奇，等.松辽黑猪H-FABP基因位点多态性研究[J].中国畜牧兽医，2007,34(3):63-66.

[7] 王重龙,陶立,猪育种中DNA标记辅助选择方法的研究进展[J].中国畜牧兽医，2008,35(2):42-47.

[8] 丁能水,周利华，等.氟烷基因对猪繁殖性能影响的研究[J].江西农业大学学报,1999，(4):552-554.

[9] 蒋思文.猪应激综合症的分子鉴别和氟烷基因利用的研究[D].武汉:华中农业大学,1996.

[10] 刘海峰,帅素容，等.猪氟烷基因对繁殖性能的影响初探[J].畜禽业,2003,9:10-11.

基金项目：吉林省科技厅资助项目（20080208）/吉林大学本科生创新实验课题（2009c81148）。

作者简介：刘昊（1988-），女，吉林长春人，吉林大学畜牧兽医学院本科在读。

通讯作者：邢沈阳（1958-），女，吉林大学畜牧兽医学院遗传学教授，硕士生导师。

注：“本文中所涉及到的图表、公式、注解等请以PDF格式阅读”