尼古丁降解菌及其在工业上的应用研究进展
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摘要综述了国内外尼古丁降解菌的主要菌属及Arthrobacter nicotinovorans菌代谢尼古丁途径的酶学、分子生物学机理研究进展，并对其在未来工业上可能的应用进行展望，以期为我国烟草科学研究、尼古丁污染生物修复和降解菌的应用提供参考。
关键词尼古丁；降解菌；工业应用；噬烟碱节杆菌
中图分类号X172文献标识码A文章编号 1007-5739（2011）11-0042-05
ResearchAdvancesOnNicotineDegradingBacteriaandItsApplicationin Industrial
DONG Chun-xia 1DIAO Ling-ling 2CHEN Yao 1MIAO Jin-lai 3LIU Fang-ming 3 *WANG Yi-bin 3
（1 Estong（Qingdao）Industry Company Ltd，Qingdao Shandong 266021； 2 Qingdao Environmental Protection Bureau Chengyang Branch；
3 First Institute of Oceanography，SOA）
AbstractA general outline of nicotine catabolism by these bacteria was presented，followed by an emphasis on new insights based on enzyme and molecular biology obtained with the catabolism of Arthrobacter nicotinovorans. Potential implications of the progress in understanding of bacterial breakdown of nicotine for technological applications were also discussed. Above of all was summarized，so as to provide base information for tobacco science，bioremediation of nicotine pollutions and other application.
Key wordsnicotine；degrading bacteria；industrial application；Arthrobacter nicotinovorans
尼古丁俗称烟碱，是一种吡啶类生物碱，主要存在于茄科烟草属（Nicotiana）植物中，是烟草体内的一种次生代谢产物，能够抵御昆虫侵害，也是烟草商业性使用的基础[1]。由于尼古丁进入中枢神经系统，由类胆碱受体调节可高度成瘾[2]，所以认为它是卷烟中的有害成分。如何降低尼古丁含量，减小其对人体和环境的危害长期以来一直吸引着各国研究者。通过研究发现，在烟草茎、叶和烟草生长土壤中都能分离到耐受尼古丁的微生物，它们能以尼古丁为氮源、碳源及能源进行生长[3-4]，通过对这些微生物的深入了解，人们发现可以利用它们降低烟叶中尼古丁的含量，还可以将其应用到生物修复技术中以减轻环境中尼古丁污染的危害。王书宁等对微生物代谢尼古丁的研究进展已有阐述[5]，但近几年来科研人员对微生物代谢的研究有了许多新的成果，这些突破性成果对认识尼古丁降解菌及其工业应用都大有裨益。现对耐受尼古丁的细菌及代谢途径进行介绍，重点讨论Arthrobacter nicotinovorans菌代谢尼古丁途径的酶学、分子生物学机理研究结果，并对其在未来工业上可能的应用进行展望，以期为我国烟草科学研究、尼古丁污染生物修复和降解菌的实质应用提供参考资料。
1尼古丁降解微生物
早在20世纪20年代，Batham就开展了微生物破坏尼古丁的观察，发现土壤中添加尼古丁后，其硝酸盐浓度增加，研究人员判断可能是土壤中细菌降解了尼古丁并转化成硝酸盐，后来分别有不同研究者观察到了类似现象，在烟草叶、种子及烟草生长土壤中都分离得到能耐受尼古丁的微生物[6]。这些微生物包括真菌、酵母菌，但绝大部分为细菌[7-8]。经过鉴定这些尼古丁降解菌主要隶于2个属：节杆菌属和假单胞菌属。其中节杆菌属主要有：Arthrobacter nicotinovorans[9-10]、Arthrobacter oxidans[11]、Arthrobacter ureafaciens[12]、Arthrobacter nicotianae[13]、Arthrobacter globiformils[10]；假单胞菌属主要有：Pseudomonas sp.[14]、Pseudomonas convexa[15]和Pseudomonas putida[16-18]。另外还有其他属细菌也能降解尼古丁：Achromo-bacter nicotinophagum[19]、Alcaligenes paradoxus[20]、Bacillus sp.[21]、Cellumonas sp.[22]、Microsporum gypseum[8]。
国内对降解尼古丁微生物关注较晚，多始于2005年前后，内容偏于筛选耐尼古丁细菌，并对其进行初步生理特征或16SrRNA分子鉴定。经研究发现，国内科研人员筛选到的耐尼古丁细菌大部分属于Pseudomonas属[23-26]和Arthro-bacter属[27-28]。李雪梅从烟草废料中筛选芽孢杆菌属Bacillus sp.X6[26]；席宇等[29]从烟叶表面分离筛选出的2株芽孢杆菌（Bacillus brevis和Bacillus laterosporus）也有显著的分解尼古丁的特性，这些降解微生物的菌属与国外研究结果一致。袁勇军等筛选到一株新的尼古丁降解菌DN2，经分子鉴定为Ochrobactrum intermedium[30]，是尼古丁降解微生物中的新属。
在筛选基础上，国内研究者主要对降解菌进行优化培养及降解菌对烟叶质量、品质[31]、烟叶尼古丁含量[32]、降解菌处置烟草废料[26，33-34]的影响研究，少有涉及代谢机理等的研究，王书宁等[35]从Pseudomonas putida Strain S16菌株内发现了一个新的基因，编码6-羟基-3-琥珀酰-吡啶羟化酶，这个酶在HSP到DHP反应过程中起作用（图1中步骤12），通过克隆测序并在Escherichia coli中表达纯化，获知该酶分子量为38 kDa，属于NADH依赖型，DNA序列含936 bp片段，通过与已有氨基酸比对，发现这是一个新酶。
2尼古丁的代谢途径
尼古丁降解细菌利用尼古丁主要是通过3种不同的途径来实现。第1种是吡啶途径（Pyridine pathway），主要存在于节杆菌属细菌中；第2种是吡咯途径（Pyrrolidine pathway），主要存在于假单胞菌属细菌中；第3种是脱甲基化途径（Me pathway），该途径主要存在真菌和其他一些种属细菌中，也是烟草植物中尼古丁代谢最常见的途径[36]。详细降解过程见图1中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ。
3尼古丁降解菌（Arthrobacter nicotinovorans）的代谢
由于人们对模式种Arthrobacter nicotinovorans 的研究比较透彻，现主要讨论其代谢尼古丁的新酶、基因、动力学及新的降解途径。此前，节杆菌属细菌代谢尼古丁的过程主要涉及5个关键酶，即图1中的步骤1～5涉及的催化酶[5]，2005年关键步骤4涉及的DHPONH酶被确定，2006年一个新的代谢步骤（图1中步骤9）被发现，其中涉及的代谢酶AO未曾见过报道；2007年研究人员新发现了尼古丁代谢的终产物――尼古丁蓝的氧化还原酶，所有这些最新的研究结果为人们提供了开阔的思路，加深了对Arthrobacter nico-tinovorans降解机理的了解，为未来尼古丁降解菌及代谢酶的生物技术应用打下了基础。
尼古丁代谢的关键一步（图1中步骤4），即[2，6-二羟基吡啶基-（3）]-甲胺丙基酮在酶催化作用下断链生成2，6-二羟基吡啶和γ-甲胺基丁酸。此前该酶一直未知，2005年，Sachelaru等[37]研究发现开发阅读框367（ORF367）蛋白是催化该反应的酶，并将其命名为2，6-二羟基假氧化型尼古丁水解酶（DHPONH）。该酶由dhponh 基因编码，是目前杂环生物降解涉及的第1个碳碳键水解酶，属于α/β折叠水解酶家族[37]。该酶的化学结构在2007年被确定[38]，野生型DHPONH酶有1个分子量为40 994 Da的亚基，它由1个110个残基的N末端域和257个残基的C末端域组成，该研究小组于2008年还确定了DHPH酶的结构[39]。DHPONH酶的发现和结构确定，从理论上完善了尼古丁代谢的途径，属于近几年来尼古丁降解途径研究中的第1个重要进展。
第2个重要进展是研究人员发现了γ-甲胺基丁酸的代谢产物。Chiribau等[40]研究发现：在甲胺基丁酸氧化酶（MABO）催化氧化作用下，γ-甲胺基丁酸被脱甲基，生成了氨基丁酸。MABO家族的酶与FAD共价结合，由nic基因簇中的mabo基因编码，两侧分别与purU 和folD基因相接，形成purU-mabO-folD操纵子，该操纵子的表达由转录阻遏物PmfR控制，并依赖于培养基中的尼古丁[41]。氨基丁酸的代谢仍未明确，可能的途径是先被脱甲基生成琥珀酸半醛，然后被氧化进入三羧酸循环（图1中步骤10）。
Chiribau研究小组对Arthrobacter nicotinovorans尼古丁代谢一直保持高度兴趣，2006年，该小组人员发现，在尼古丁代谢最后一步，存在2种代谢途径[42]。除了γ-甲胺基丁酸在MABO酶催化下脱甲基生成氨基丁酸，他们又发现一种新酶催化另一个反应。这个新酶是甲胺酶，该酶非共价键结合FDA，对底物也具有专一性，酶基因的表达依赖于尼古丁存在，受PmfR控制 ，在其催化下，γ-甲胺基丁酸能被去甲胺基，变成琥珀酸半醛和甲胺，琥珀酸半醛在琥珀酸半醛脱氢酶（SsaDH，该酶由pAO1上的sad基因编码）的催化下，变成琥珀酸（图1中步骤11），琥珀酸进入三羧酸循环完成尼古丁代谢。研究发现，MABO和甲胺酶共同分享底物，运用纯化重组酶测定MABO和甲胺酶的米氏常数和催化常数，表明甲胺酶的催化效率更高，kcat/Km比值说明，MABO约为AO的催化活力的10倍。但最终培养液中有甲胺的分泌，说明甲胺途径也是存在的，而2个酶如何争夺底物尚不清楚。当细菌在有尼古丁的柠檬酸盐培养基中生长时，AO酶的活性比MABO更强。
Marius Mihasan等[43]于2007年发现了尼古丁代谢途径中的一种新酶：NAD（P）H-尼古丁蓝氧化还原酶（NBOR），该酶的基因依赖尼古丁表达，在转录激活体PmfR的控制下进行编码，属于尼古丁调节子的一部分。该酶含黄素腺嘌呤单核苷酸（FMN），通过2电子转移，利用辅酶NADH和NADPH将尼古丁蓝催化还原成对苯二酚形式，免于生成黄素和尼古丁半醌，能减少产生活性氧自由基，使细菌降低氧化压力，研究人员因此推断这可能是一种有利性选择的进化。该研究小组还对比了Arthrobacter nicotinovorans和Noc-ardioides sp. strain JS614的降解途径，发现二者的代谢途径非常相近，NDH、6HPONH、6HLNH等酶催化相同的反应，2个代谢终产物甲胺和尼古丁蓝也是相同的。2个菌的代谢区别在于编码酶的基因位置不同，Arthrobacter nico-tinovorans在质粒上，而Nocardioides sp. strain JS614在染色体上[44]。
迄今为止Arthrobacter nicotinovorans的代谢步骤基本清楚，每一步的催化酶也确定，通过对代谢酶以及表达基因的深入研究，可以从深层次了解酶的反应动力学及代谢产物的转运等。外排泵多见于耐药细菌体内，位于细胞膜上，是细菌抗药的一个重要机制[45]，Petra Ganas等[46]从尼古丁降解菌中发现了1个双组分的外排泵：pAO1 NepAB，编码这个泵的基因分别是nepA和nepB，这个外排泵负责把尼古丁代谢产物输送到细胞外，实际上，这个外排泵扮演了一个代谢阀的角色，在代谢过程中，一旦甲胺基丁酸累积了，这个泵就启动，nepAB表达，细胞开始排放甲胺，添加质子动力抑制剂能明显抑制甲胺的外排，说明这个泵的能力来自质子动力（PMF）。这是目前为止被发现的第1个控制细胞内代谢物浓度的SMR泵。
4尼古丁降解菌的应用
4.1环保工业应用
尼古丁降解菌最令人激动的应用首推生物修复。生物修复的技术是指利用生物的降解作用，将土壤、地下水或海洋中的危险污染物降解为二氧化碳和水，或是使污染物无害化[47]，因其高效、经济且生态可承受等优点而备受推崇。卷烟加工过程中产生的固体废物最大的特点是包含高浓度的尼古丁（2 000 mg/kg固体废料），尼古丁不仅是一种有毒化合物，而且水提物中总有机碳含量很高（12 620.0 mg/L）[48]，因此尼古丁废物不能以普通的城市废物方式处理。像很多工农业废物可以被好氧降解的生物修复技术处理一样，烟草废料同样可以[49]，Felicita Briski等[48]通过试验研究表明，经过16 d的微生物堆肥处理后，烟草废料中尼古丁含量减少80%，效果非常显著，生物降解过程中占优势的微生物是细菌和真菌。魏霞等[50]对丝状真菌降解尼古丁和绿原酸进行了研究，结果表明，所用丝状真菌在经乙醇浸提后的烟草废料培养料中生长良好，其中脉孢菌与曲霉混合培养可以协同降解尼古丁，效果更好，可以考虑将真菌制成绿色无公害有机肥料生产用发酵菌剂。由此可见，尼古丁降解菌处理烟草废料不仅降低了尼古丁含量，同时降解产物还可以作为土壤调节剂和肥料，是一举两得的污染清除方法。尼古丁降解菌代谢过程中产生的酶还能应用于烟气中尼古丁的清除。固定化酶是指将水溶性酶用物理或化学方法处理，使之成为不溶于水的但仍具有酶活性的状态，经过固定化的酶不仅具有高的催化效率、高度专一性，并且酸碱稳定性和温度稳定性提高，酶的使用寿命延长[51]。将尼古丁降解菌代谢过程酶NDH和6HLNO提取，并进行固定化，置于空气过滤器内，将能有效降低空气中尼古丁含量，这种空气过滤器可以应用于烟草工业废气的预处理，还可以安装在吸烟区，以减少吸烟产生尼古丁对人体及环境的危害[52]。
4.2医药工业应用
生物碱生物转化是一种非常有效的药物生产方法。如果已知一种药物采用化学方法难以合成或产率很低时，人们往往会考虑生物转化，通过生物转化将会更容易获得新药的先导化合物[53-54]。降解菌代谢尼古丁过程涉及的酶，不仅可以用于烟草废物的生物修复，也可以促使合成新工业产品和药物的先导化合物[55-56]。吡啶是合成非成瘾性镇痛药物epibatidine的先导化合物，尼古丁与epibatidine是结构类似物，然而通过化学方法用吡啶或吡咯环进行功能化比较困难，这限制了用尼古丁作原料半合成吡啶的发展。很久以前人们就知道一些微生物可以利用尼古丁生长生成各种代谢产物，但这些代谢产物从来没有被用来作为生成尼古丁类似物的原料。通过研究人们发现用Arthrobacter oxydans NRRL-B-3603和 Pseudomonas sp. DSM 8653菌处理尼古丁，可以生成（s）-6-羟基尼古丁和4-[6-羟基-吡啶基-（3）]-4-氧化丁酸2种化合物（图2），通过进一步处理，这2种物质可以生成2，5取代或2，3，5取代吡啶，然后进一步合成吡啶和epibatidine[56]，使利用生物转化生产药物变得可行。
4.3生物工业应用
由于环境污染物能引发一系列危害，人们需要对环境样品潜在的毒性进行快速检测，生物传感器是利用生物高分子物质来检测特殊化合物的一种电子元件，经基因工程改造的微生物构建生物传感器可以发展为一种原位环境检测手段，比如工程化的大肠杆菌已被广泛用来作为检测遗传毒性物的生物传感器[57]。根据已有对尼古丁降解菌代谢酶的认识，人们希望通过努力能在尼古丁降解菌中以一种活性形式来合成转录调节因子，该调节因子表达合成蛋白后能结合尼古丁，因此可以作为响应尼古丁的效应物分子，将调节因子等相关基因利用大肠杆菌进行表达，产生的蛋白即可发展成为一种尼古丁敏感探测装置[56]。6HDNO酶操纵部位的启动子及阻遏蛋白HdnoR（结合到操纵子部位）已被用来构建可诱导的哺乳动物表达系统，该系统可对6羟基化尼古丁进行响应[58]，为尼古丁探测装置研制提供了基础。
4.4科研用途
D-（+）-nicotine常被用于尼古丁与中枢神经胆碱受体相互作用的研究中，因此需要对混旋的尼古丁进行分离。研究人员曾采用Pseudomonas putida对尼古丁代谢进行选择性分离，将 DL-（±）-nicotine 中天然存在的L-（－）-nicotine 选择性代谢，而非天然存在的D-（+）-nicotine因不能被代谢得以分离[5]。Sandu等[59]构建了2个载体：pART2 and pART3，并证实了它们在 Arthrobacter spp.菌体内过量表达蛋白的功能和有效性，这些载体可被应用于过量表达脱氢酶和酮脱氢酶以进行Arthrobacter nicotinovorans的生化研究，而且质粒可应用于对Arthrobacter spp.的遗传互补研究中。
5结语
尼古丁降解菌在工业、科研上应用潜力巨大，目前国外对其研究仍保持相当的热度，尼古丁降解机理、降解酶分析、相关蛋白分析、降解动力学、降解菌遗传学、分子生物学等每年均有大量研究，可充分利用国外研究者成果，加强对Arthrobacter属细菌的实际应用研究，以便为我国烟草科研、尼古丁污染生物修复和尼古丁降解菌在其他行业技术应用提供充足资料，加速产业化进程。此外，还应对Arthrobacter属以外其他细菌及真菌代谢尼古丁进行深入研究，掌握尼古丁降解多样性途径和不同机理，拓宽尼古丁降解菌生物技术应用领域范围，为人类和生态环境健康作出有益探索。
6参考文献
[1] 沈嘉，程新胜.植物抗虫性物质烟碱的研究进展[J].热带亚热带植物报，2007，15（5）：459-464.
[2] HUKKANEN J，JACOB P，BENOWITZ N L.Metabolism and disposition kinetics of nicotine [J].Pharmacol Rev，2005（57）：79-115.
[3] SCHENK S，HOELZ A，KRAUSSB，et al.Gene structures and properties of enzymes of the plasmid-encoded nicotine catabolism of Arthrobacter nicotinovorans[J].Mol.Biol，1998（284）：1323-1339.
[4] BAITSCH D，SANDU C，BRANDSCH R，et al.Gene cluster on pAO1 of Arthrobacter nicotinovorans involved in degradation of the plant alkaloid nicotine：cloning，purification，and characterization of 2，6-dihydroxypy-ridine 3-hydroxylase[J].J Bacteriol，2001（183）：5262-5267.
[5] 王书宁，杜毅，陈洪，等.微生物代谢尼古丁研究进展[J].中国生物工程杂志，2004，24（7）：50-54.
[6] HYLIN J W.Microbial degradation of nicotine 1.morphology and physio-logy of Achromobacter nicotinophagum N SP[J].Bacteriol，1958（76）：36-40.
[7] UCHIDA S，MAEDA S，KISAKI T.Conversion of nicotine into nornicotine and N-methylmyosmine by fungi[J].Agric Biol Chem，1983（47）：1949-1953.
[8] SINDELAR R D，ROSASZA J P，BARFKNECHT C F.N-demethylation of nicotine and reduction of nicotine-1′-N-oxide by Microsporum gyps-eum[J].Appl Environ Microbiol，1979（38）：836-839.
[9] DECKER K，BLEEG H.Induction and purification of steteospecific nico-tine oxidizing enzymes from Arthrobacter oxidans[J].Biochim Biophys Acta，1965（105）：313-324.
[10] UCHIDA S，MEDA S，MASUBUCHI T，et al.Isolation of nicotine-degr-ading bacteria and degradation of nicotine in shredded tobacco and tobacco extract[J].Sci Pap，1976（118）：197-201.
[11] SGUROS P L.Microbial transformations of the tobacco alkaloids Ⅰ.Cul-tural and morphological characteristics of a nicotinophile[J].Bacteriol，1955（69）：28-37.
[12] GHERNA R L，RICHARDSON S H，RITTENBERG S C.The bacterial oxidation of nicotine Ⅵ.The metabolism of 2，dihydroxypseudooxynicotine[J].Biol Chem，1965（240）：3669-3674.
[13] GIOVANNOZZI-SERMANNI G.Arthrobacter nicotianae，a newtypeof Arthrobacter causing nicotine degradation[J].Coresta，1959（3）：2595.
[14] WADA E，YAMASAKI K.Degradation of nicotine by soil bacteria[J].JAm Chem Soc，1954（76）：155-157.
[15] THACKER R，RRVIGO，KAHLON P，et al.NIC，a conjugative nicotine nicotinate degradative plasmid in Pseudomanas convexa[J].J Bacteriol，1978（135）：289-290.
[16] NEWTON，RICHARD P，GEISS，et al.Process for reduction of nicotine content of tobacco by microbial treatment：US 4037609[EB/OL].（1977-07-26）.http：//v3.省略/publicationDetails/biblio?KC=A&date=19770726&NR=4037609A&DB=EPODOC&locale=en_EP&CC=US& FT=D.
[17] DETRAGLIA M C，TOMETSKO A M.Separationof D2（+）2nicotinefrom a racemic mixture by stereospecific degradation of the L2（-）isomer with Pseudomonas putida[J].Appl Environ Microbiol，1980（39）：1067-1069.
[18] EDWARDS W B，MCCUEN R.Preparation of optically pure（R）2（+）2 nicotine.Studieson the microbial degradationof nicotinoids[J].J Org Chem，1983（48）：2484-2487.
[19] HYLIN J W.The microbial degradation of nicotine.Ⅱ.The mode of acti-on of Achromobacter nicotinophagum[J].Arch Biochem Biophy，1959（83）：528-537.
[20] SCHENK S，HOELZ A，KRAU B，et al.Gene structures and properties of enzymes of the plasmid-encoded catabolism of Arthrobacter nicotino-vorans[J].J Mol Biol，1998（284）：1323-1339.
[21] BUCHERER H.?ber den mikrobiellen Abbau von Giftstoffen I Mitte-ilung：?ber den mikrobiellen Abbau von Nikotin[J].Zent Bl Bakteriol，1942（105）：166-173.
[22] GRAVELYL E，GEISS V L，NEWTON R P.Process for maximizing the growth and nicotine degrading activity of microorganisms：US 4011141[EB/OL].（1977-03-08）.http：//v3.省略/publicationDetails/biblio?KC=A&date=19770308&NR=4011141A&DB=EPODOC&locale=en_EP&CC=US&FT=D.
[23] SHU NING WANG，ZHEN LIU，HONG ZHI TANG，et al.Characteriz-ation of environmentally friendly nicotine degradation by Pseudomonas putida biotype A strain S16[J].Microbiology，2007（153）：1556-1565.
[24] HAI LEI WEI，LI PING LEI，ZHEN YUAN XIA，et al.Characterisation of a novel aerobic nicotine-biodegrading strain ofPseudomonas putida[J].Annals of Microbiology，2008，58（1）：41-45.
[25] AIDONG RUAN，HANG MIN，XIAOHUI PENG，et al.Isolation and ch-aracterization of Pseudomonas sp. strainHF-1，capable of degrading nicotine[J].Research in Microbiology，2005（156）：700-706.
[26] 李雪梅，陈育如，骆跃军，等.两株芽胞菌对烟草废料烟碱与绿原酸降解的研究[J].生物加工过程，2005，3（4）：58-62.
[27] 夏振远，雷丽萍，吴玉萍，等.降烟碱细菌-烟草节杆菌 K9的分离及鉴定[J].中国烟草科学，2006（2）：1-4.
[28] 马林，武怡，曾晓鹰，等.降解烟碱微生物的筛选及其酶在烟草中的应用[J].烟草科技，2005（9）：6-10.
[29] 席宇，孙淑红，杨艳坤，等.微生物降解尼古丁的研究与应用进展[J].河南农业科学，2007（3）：9-13.
[30] 袁勇军，陆兆新，黄丽金，等.烟碱降解细菌的分离、鉴定及其降解性能的初步研究[J].微生物学报，2005，45（2）：181-184.
[31] 李雪梅，杨伟祖，祝明亮，等.烟碱降解菌的选育及改善上部烟叶品质研究[J].工业微生物，2006，36（1）：16-22.
[32] 李梅云，雷丽萍，郭荣君，等.微生物对烤烟叶片烟碱含量的影响[J].中国农学通报，2006，22（9）：94-96.
[33] 袁勇军，陆兆新，别小妹，等.DN2菌降解烟碱的动力学及其应用研究[J].中国生物工程杂志，2006，26（3）：47-51.
[34] WANG S N，XU P，TANG H Z，et al.Biodegradation and detoxification of nicotine intobacco solid waste by a Pseudomona ssp[J].Biotechnology Letters，2003（26）：1493-1496.
[35] HONGZHI TANG，SHUNING WANG，LANYING MA，et al.A Novel Gene，Encoding 6-Hydroxy-3-Succinoylpyridine Hydroxylase，Invo-lved in Nicotine Degradation by Pseudomonas putida Strain S16[J].Applied and environmental microbiology，2008，74（5）：1567-1574.
[36] RICHARD J ROBINS.Progress in understanding the N-demethylation of alkaloids by exploiting isotopic techniques[J].Phytochem Rev，2007（6）：51-63.
[37] SACHELARU P，SCHILTZ E，IGLOI G L，et al.An alpha/beta-fold C-C bond hydrolase is involved in a central step of nicotine catabolism by Arthrobacter nicotinovorans[J].J Bacteriol，2005（187）：8516-8519.
[38] CHRISTIAN SCHLEBERGER，PAULA SACHELARU，RODERICH B-RANDSCH，et al.Structure and Action of a C-C Bond Cleaving α/β-Hydrolase Involved in Nicotine Degradation[J].Mol Biol，2007（367）：409-418.
[39] NORA T，GEORG，SCHULZ.Structure of 2，6-Dihydroxypyridine 3-hydr-oxylase from a Nicotine-degrading Pathway[J].Mol Biol，2008（379）：94-104.
[40] CHIRIBAU CB，SANDU C，FRAAIJE M，et al.A novel γ-N-methy-lam-inobutyrate demethylating oxidase involved in catabolism of the tobacco alkaloid nicotine by Arthrobacter nicotinovorans pAO1[J].Eur J Biochem，2004（271）：4677-4684.
[41] CHIRIBAU C B，SANDU C，IGLOI G L.et al.Characterization of PmfR，the transcriptional activator of the pAO1-borne purU-mabO-folD ope-ron of Arthrobacter nicotinovorans[J].Bacteriol，2005（187）：3062-3070.
[42] CHIRIBAU CB，MIHASAN，M GANAS P.et al.Final steps in nicotine degradation.Deamination versus demethylation of gamma-N-methyla-minobutyrate[J].FEBS J，2006（273）：1528-1536.
[43] MARIUS MIHASAN，CALIN-BOGDAN CHIRIBAU，THORSTEN FRI-EDRICH.An NAD（P）H-Nicotine Blue Oxidoreductase Is Part of the Nicotine Regulon and May Protect Arthrobacter nicotinovorans from Oxidative Stress during Nicotine Catabolism[J].Applied and environ-mental microbiology，2007，73（8）：2479-2485.
[44] PETRA GANAS，PAULA SACHELARU，MARIUS MIHASAN.Two clo-sely related pathways of nicotine catabolism in Arthrobacter nicotin-ovorans and Nocardioides sp.strain JS614[J].Arch Microbiol，2008（189）：511-517.
[45] JIA BEI，HUANG WEN XIANG，HUANG AI LONG.Bacterial multi drug efflux pump systemsand updates of analysis approach[J].中国抗生素杂志，2007，32（4）：203-210.
[46] PETRA GANAS，MARIUS MIHASAN，GABOR L IGLOI.A two-comp-onent small multidrug resistance pump unctions as a metabolic valve during nicotine catabolism by Arthrobacter nicotinovorans[J].Microbiol-ogy，2007（153）：1546-1555.
[47] 季秀玲，魏云林.低温微生物环境污染修复技术研究进展[J].环境污染治理技术与设备，2006，7（10）：6-11.
[48] FELICITA BRISKI，NINA HORGAS，MARIJA VUKOVIC.et al.Aerobic composting of tobacco industry solid waste―simulation of the process[J].Clean Techn Environ Policy，2003（5）：295-301.
[49] KAYHANIAN M，TCHOBANOGLOUS G.Innovative two-stage process for the recovery of energy and compost from the organic fraction of municipal solid waste[J].Water Sci Technol，1993（27）：133-143.
[50] 魏霞，郭月霞，陈育如，等.丝状真菌对烟草废料中烟碱和多酚的降解效果[J].江苏农业科学，2008（3）：260-262.
[51] 王镜岩，朱圣庚，徐长法.生物化学[M].3版.北京：高等教育出版社，2006.
[52] RODERICH BRANDSCH.Microbiology and biochemistry of nicotine degradation[J].Appl Microbiol Biotechnol，2006（69）：493-498.
[53] RAKALOIDS D A，LISTER D L，BRUCE N C.Biotransformation of alkaoids[J].Alkaloids chem Biol，2002（58）：1-82.
[54] LISTER D L，KANUNGO G，RATHBONE D A.Transformation of codeine to important semisynthetic opiate derivatives by Pseudomonas putida m10[J].Fems Microbiol Lett，1999（181）：137-144.
[55] RODUIT J P，WELLIG A，KIENERT A.Renewable functionalized pyri-dines derived from microbial metabolites of the alkaloid（S）-nicotine[J].Heterocycles，1997（45）：1687-1702.
[56] SCHMID A，DORDICK J S，HAUER B.et al.Industrial biocatalysis today and tomorrow[J].Nature，2001（409）：258-268.
[57] KOSTRZYNSKA M，LEUNG K T，LEE H，et al.Green fluorescent pro-tein-based biosensor for detecting SOS-inducing activity of genotoxic compounds[J].Microbiol Methods，2002，48（1）：43-51.
[58] MALPHETTES L，WEBER C C，ELBABA M D，et al.A novel mamm-alian expression system derived from components coordinating nicotine degradation in Arthrobacter nicotinovorans pAO1[J].Nucleic Acids Res，2005（33）：107.
[59] SANDU C，CHIRIBAU CB，SACHELARU P，et al.Plasmids for nicotine-dependent and independent gene expression in Arthrobacter nicotinovo-rans and other Arthrobacter species[J].Applied and environmental mic-robiology，2005，71（12）：8920-8924.
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