尿多酸肽作用于肺肿瘤小鼠的研究

开篇：润墨网以专业的文秘视角，为您筛选了一篇尿多酸肽作用于肺肿瘤小鼠的研究范文，如需获取更多写作素材，在线客服老师一对一协助。欢迎您的阅读与分享！

摘要：目的 研究尿多酸肽（CDA-2）作用于转移性肺肿瘤小鼠的机制。方法 通过注射鼠Lewis 肺癌细胞到C57BL/6小鼠体内建立小鼠转移性肺癌模型。采用HE染色对小鼠肺部肿瘤数、肿瘤大小进行评价。利用Kaplan-Meier（K-M）生存率曲线分析小鼠生存情况。免疫组化方法检测小鼠肿瘤增殖抗原Ki-67的表达；TUNEL凋亡免疫组化染色观察肿瘤细胞的凋亡。结果 经CDA-2治疗后，小鼠的肺肿瘤数和最大肿瘤尺寸均显著低于PBS组肿瘤小鼠，并且CDA-2呈剂量依赖性抑制肿瘤的生长（均P

关键词：尿多酸肽；肺癌；肿瘤生长；生存期；增殖；凋亡

根据2010年癌症统计数据显示，肺癌已成为全球死亡率最高的肿瘤[1]，其主要原因是患者在发现肺癌时多处于中晚期且现有的治疗方案，如手术、放疗和化疗等，均存在一定缺陷，不能起到有效的治疗作用。尿多酸肽（cell differentiation agent 2，CDA-2）作为我国研发的一种抗肿瘤新药，是从健康人尿中分离提取的含有天然活性成分的非细胞毒性药物，该药具有促进细胞分化及诱导细胞凋亡等功能[2]。前期临床研究显示，CDA-2对白血病和肝癌等多种实体和非实体肿瘤有较好疗效及防预[3，4]。本研究通过建立小鼠转移性肺癌模型，观察CDA-2对小鼠肺部肿瘤生长的影响、肿瘤小鼠生存时间的影响及肿瘤细胞增殖或凋亡的影响，来初步了解CDA-2在肺癌治疗中的作用。

1资料与方法

1.1实验动物 C57BL/6雌性小鼠购自国家啮齿类实验动物种子中心上海分中心。

1.2主要试剂 胎牛血清购自美国Invitrogen公司；DMEM培养基、青霉素、链霉素购自美国Hyclone Laboratories 公司；CDA-2由合肥永安制药有限公司惠赠；鼠抗Ki-67 购自英国Abcam公司；EnVision +System-HRP （AEC）试剂盒购自美国Dako公司；TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒购自Promega公司。

1.3实验方法

1.3.1 细胞培养 鼠Lewis 肺癌 （Lewis lung carcinoma，LLC）细胞来源于美国菌种保藏中心，在DMEM完全培养液（添加10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素） 中常规培养。

1.3.2 动物模型的建立及CDA-2治疗方案 通过尾静脉注射法，将2×105个LLC肿瘤细胞注射到C57BL/6小鼠体内。14d后， PBS（对照组）及不同浓度CDA-2（500，1000，2000 mg/kg）分别通过腹腔注射入小鼠体内，1次/d连续10d。

1.3.3小鼠肺肿瘤评价方法 根据文献[5]对小鼠肺肿瘤的肿瘤数和最大肿瘤尺寸进行评价，具体方法：在第25d，PBS组和CDA-2组小鼠被处死，先用4%多聚甲醛经小鼠气管对肿瘤负荷的肺进行灌注，然后将整个肺取出，存放到4%多聚甲醛中固定。固定24h后，全肺被石蜡包埋。将肺肿瘤石蜡块切成连续的350 mm的切片，用HE染色后，对肺肿瘤进行计数和测量肿瘤的尺寸。

1.3.4免疫组化检测 肿瘤负荷肺组织用4%多聚甲醛固定后，石蜡包埋、切片。切片经60℃孵育过夜后脱蜡，再将其放于0.01M柠檬酸缓冲液（pH6.0）中，微波炉100℃加热20min进行抗原修复。切片用3% H2O2抑制非特异性氧化酶后，在2% 封闭液中孵育60min，然后加Ki-67抗体4℃孵育过夜，根据EnVision +System-HRP （AEC）试剂盒说明书进行第二抗体的孵育和染色，复染使用苏木精。Ki-67阳性细胞统计方法：每张切片选择6个高倍视野，共观察1000个肿瘤细胞，计算平均阳性细胞比例，以百分率代表Ki-67阳性细胞比率。

1.3.5 TUNEL检测 蜡块按常规切片， TUNEL检测操作按Promega公司细胞凋亡原位检测试剂盒说明书规范进行。设阳性和阴性对照。TUNEL 染色阳性细胞棕黄色颗粒位于细胞核。每张切片选择6个高倍视野，共观察1000个肿瘤细胞，计算平均阳性细胞比例，以百分率代表肿瘤细胞凋亡率。

1.4统计学处理 实验数据以x±s表示。两组或多组间比较采用t检验和Kaplan-Meier生存分析。以P

2结果

2.1 CDA-2对小鼠转移性肺癌生长的影响 用PBS及500～2000mg/kg CDA-2分别注射到转移性肺肿瘤小鼠体内，连续10d后，观察小鼠肺部肿瘤生长情况。结合小鼠肺外观及HE染色结果显示，注射PBS的肿瘤小鼠其肿瘤数为（45.2±10.6）个，最大的肿瘤尺寸达到了（5.4±0.4）mm，而肿瘤小鼠注射CDA-2后肿瘤数及最大肿瘤尺寸均有显著降低（P

图1 肿瘤小鼠注射PBS和不同浓度CDA-2后肺肿瘤形态（上）及HE染色结果（下）

2.2 CDA-2对肿瘤小鼠生存时间的影响 部分注射了PBS或500～2000mg/kg CDA-2的肺肿瘤小鼠被用于观察生存时间的长短，结果显示，经PBS处理的肺肿瘤小鼠平均寿命为28.1d，而CDA-2治疗的肿瘤负荷小鼠随着药物剂量的增加其寿命也不断延长， 500mg/kg CDA-2治疗后小鼠平均寿命为35.5d，1000mg/kg CDA-2治疗后为40.1d，而2000mg/kg CDA-2治疗后小鼠平均寿命延长至45.9d（图2）。

图2 肺肿瘤小鼠注射不同浓度CDA-2后的生存时间比较

2.3 CDA-2与肺肿瘤细胞的关系 为了进一步了解CDA-2对肺肿瘤细胞的作用，Ki-67免疫组化方法和TUNEL方法分别用于检测肿瘤细胞的增殖及凋亡情况。结果显示，注射PBS的肿瘤小鼠Ki-67阳性细胞为（38.6±13.3）%，而肿瘤小鼠经2000mg/kgCDA-2处理后，其Ki-67阳性细胞为（10.8±4.3）%，两组比较Ki-67阳性细胞数有显著降低（P

3讨论

近年来，随着肺癌发病率及死亡率的不断升高，越来越多的研究小组致力于肺癌治疗的研究。但现有治疗方法均存在一定缺陷，因此，抗肺癌新方法的研究迫在眉睫。CDA-2包含多种活性成份：苯乙酰谷氨酰胺，马尿酸，肽（MW400-2800），4-羟基苯乙酸，5-羟基吲哚乙酸[2]。目前已被发现具有多种生物功效，如抗肿瘤细胞增殖、诱导细胞凋亡、促进细胞分化及调控基因表达等[6]，同时可以保护正常细胞的氧化损伤及DNA损伤[7]。在本研究中，我们首次通过建立转移性肺肿瘤小鼠模型来研究CDA-2对肺癌的作用，结果显示：CDA-2可抑制小鼠转移性肺癌的生长且随着剂量的增加延长小鼠的生存时间；而在细胞层面，CDA-2可抑制肿瘤细胞增殖、诱导细胞凋亡。

前期临床研究显示，CDA-2对于肝癌、乳腺癌、大肠癌及白血病等多种实体和非实体肿瘤均具有较好的疗效，可控制肿瘤的生长且改善患者的生活质量[8]。在肺癌研究中也发现尿多酸肽联合NP方案（长春瑞滨NVB、顺铂DDP）治疗晚期非小细胞肺癌患者，具有一定的疗效可减轻化疗毒副作用且可显著延长患者的生存期[9]。在本实验中，我们得到了与以往研究一致的结果，结果显示CDA-2可显著抑制小鼠的肺部肿瘤生长且肿瘤个数及肿瘤大小随着CDA-2剂量的增加而减小。并利用K-M曲线分析了CDA-2剂量与肿瘤小鼠生存时间的关系，结果显示CDA-2治疗肿瘤小鼠后其生存期与对照组比较有显著的延长且与CDA-2剂量呈正相关。

无限制增殖是恶性肿瘤细胞最显著的生物特征之一；而凋亡是维护机体稳定而发生的程序性细胞死亡，凋亡途径的紊乱也可导致癌症的发生。大量研究表明CDA-2可有效抑制肿瘤细胞的增殖并且诱导细胞凋亡，如叶东宝等的报告显示CDA-2可明显抑制人多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226的生长并诱导细胞株的凋亡[10]；在王红兵等发表的肺癌体外研究报告中显示，CDA-2可有效的抑制肺腺癌细胞株A549的增殖，并呈CDA-2剂量依赖性抑制[11]；王旋等的体外研究报告发现CDA-2可显著诱导肺腺癌细胞株A549的细胞凋亡[12]。在本实验中，我们将CDA-2作用于肺肿瘤小鼠，通过免疫组化染色及TUNEL方法检测小鼠肺肿瘤细胞的增殖率及凋亡率，结果显示肿瘤小鼠经CDA-2治疗后肿瘤细胞的增殖率不断降低，反之凋亡细胞数不断升高，得与其他研究结论相似。

综上所述，CDA-2作为一种新型的抗肿瘤药物，可有效抑制小鼠转移性肺癌的生长并可显著延长小鼠的生存时间，且主要通过抑制肿瘤细胞的增殖及诱导细胞凋亡来产生作用。

参考文献：

[1] Jemal A， Siegel R， Xu J， et al. （2010） Cancer statistics [J]. CA Cancer J Clin， 2010，60：277-300.

[2]廖明微.聪明的抗癌药CDA-2[M].台北：世贸出版社，1999：149-161.

[3]Huang J， Yang M， Liu H， et al. CDA-II， a urinary preparation， induces growth arrest and apoptosis of human leukemia cells through inactivation of nuclear factor-kappaB in a caspase-dependent manner [J]. Food Chem Toxicol， 2009， 47： 40-49.

[4]Lin WC， Liao YC， Liau MC， et al. Inhibitory effect of CDA-II， a urinary preparation， on aflatoxin B（1）-induced oxidative stress and DNA damage in primary cultured rat hepatocytes [J]. Food Chem Toxicol， 2006， 44： 546-551.

[5]Takahash H， Ogata H， Nishigaki R， et al. Tobacco smoke promotes lung tumorigenesis by triggering IKKbeta- and JNK1-dependent inflammation [J]. Cancer Cell， 2010， 17： 89-97.

[6]Liau MC and Burzynski SR. Separation of active anticancer components of antineoplaston A2， A3 and A5 [J]. Int J Tissue React， 1990， 7 （Suppl.）：1-17.

[7]Lin WC， Wu YW， Lai TY， et al. Effect of CDA-II， urinary preparation，on lipofuscin， lipid peroxidation and antioxidant systems in young and middleaged rat brain [J]. Am J Chin Med， 2001， 29： 91-99.

[8]李青，冯奉仪，陈强，等.尿多酸肽注射液治疗晚期肿瘤的临床研究[J].中华肿瘤杂志，2008，30：534.

[9]唐俊舫，徐丽艳，朱允中，等.尿多酸肽联合NP与NP方案化疗在晚期非小细胞肺癌的随机对照临床研究[J].中国肺癌杂志，2006，6：536-539.

[10]叶宝东，沈一平，周郁鸿，等.尿多酸肽诱导多发性骨髓瘤细胞凋亡的实验研究[J].浙江中医药大学学报，2010，34：650-651，657.

[11]王红兵，王亚丽，刘德生，等.尿多酸肽对人肺腺癌A549细胞的作用及人肺腺癌A549细胞株E-cadherin基因甲基化的研究[J].实用癌症杂志，2010， 25： 445-452.

[12]王旋，李冬，姜翠敏.尿多酸肽对人非小细胞肺癌细胞生长与凋亡的影响 [J].中国医院药学杂志，2012， 32（17）：1329-1333.